益生菌||丁酸梭菌的研究應用進展
導讀
丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又名宮入菌、酪酸梭菌，細菌學分類屬于梭菌屬（Clostridium），是一種厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，培養(yǎng)后期細菌的革蘭氏染色呈陰性。丁酸梭菌是人和動物腸道的正常菌群，也廣泛的存在于土壤、奶酪和天然酸奶中。菌體呈直桿狀或稍有彎曲，單個或成對，灰白色，細菌直徑為（0.5-1.7）×（2.4-7.6）μm，兩端鈍圓，周身鞭毛，具運動性；芽孢偏心或次端生（內生），呈圓形或橢圓形，無孢外壁和附屬絲。在瓊脂平板上形成白色或奶油色的不規(guī)則圓形菌落，稍突，表面濕潤光滑，不透明，略有酸臭味。
丁酸梭菌具有抵抗外界相對惡劣環(huán)境的理化性質。經80℃、30 min 和90℃、10 min 熱處理不會失活，最適生長溫度為36℃，最高和最低起始生長溫度為44℃和16℃ ；pH 1.0 時仍能存活，其最適起始生長pH 為7.2，最高和最低起始生長pH 為10.6 和4.6 ；最適起始氧化還原電位為-21 mV。在體內丁酸梭菌能耐受胃液、膽汁酸和消化液的作用，在室溫下具良好的儲存性與穩(wěn)定性；丁酸梭菌只對新生霉素、萬古霉素和四環(huán)素等少數抗生素敏感，對其他多種抗生素具有很強的耐藥性，具有良好的應用前景。
1丁酸梭菌及其代謝產物的功能研究進展
1.1 調節(jié)腸道微生態(tài)平衡
丁酸梭菌具有防止病原菌及腐敗菌在腸道內的異常增殖和促進腸道有益菌群增殖、發(fā)育的雙重作用，從而糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的產生。
丁酸梭菌對艱難梭菌具生物拮抗作用，初步證實是通過細胞緊密接觸抑制毒性蛋白的表達，其抑制機理仍待深入研究。兩種菌在體外共培養(yǎng)時，艱難梭菌的毒性大幅度降低甚至消失，主要是因為丁酸梭菌芽孢萌發(fā)與擴增的速率是艱難梭菌的兩倍，產生的短鏈脂肪酸更有效的抑制艱難梭菌芽孢的萌發(fā)及其生長。陳秋紅等研究表明丁酸梭菌具有較強的耐高溫、耐酸和耐膽鹽的生物學特性，對腸道致病菌大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌具較強的抑制作用，同時顯著促進腸道有益菌的生長，丁酸梭菌發(fā)酵提取物分別使試驗組嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和糞鏈球菌的活菌數比對照組提高了100%、93.3% 和81.3%（P<0.05）。
1.2 增強免疫功能，促進動物的生長
在臨床應用中，用熱滅活的丁酸梭菌制成的疫苗具有激活巨噬細胞和NK 細胞的作用，口服丁酸梭菌顯著增加了血清中IgA 和IgM 含量。利用丁酸梭菌發(fā)酵動物飼料能降低飼料中的抗營養(yǎng)因子，提高氨基酸、維生素、有機酸和有機磷等營養(yǎng)物質，改善適口性、攝入量和利用率；添加到動物飼料具有替代抗生素預防和治療相關動物疾病的潛力，抑制內源性疾病的發(fā)生，且增強機體免疫和血液中白細胞（CD4+）的數量，以及改善動物的生產性能和產品質量，減少抗生物用量，提高經濟效率。張彩云等在斷奶仔豬的日糧中添加1‰的丁酸梭菌，顯著提高了仔豬的平均日增重，添加3‰的丁酸梭菌能顯著提高仔豬飼料的轉化效率，添加3‰和5‰的丁酸梭菌，其免疫機能、抗病力均明顯提高，其中添加5‰丁酸梭菌組的血清乳酸脫氫酶的活性顯著低于抗生素對照組，IgG 水平、C3 水平顯著高于抗生素對照組。在鮸魚飼料中添加一定量的丁酸梭菌，其血清酚氧化酶活力、酸性磷酸酶活力顯著高于對照組（P<0.05），血清與體表黏液中的溶菌酶活性、IgM 水平以及其生長均顯著增高，故丁酸梭菌能調節(jié)鮸魚的體液免疫應答和改善其生長性能。
1.3 產生益生物質
丁酸梭菌的主要代謝產物是丁酸（表1），而丁酸是結腸上皮細胞的能量代謝和正常生長主要的營養(yǎng)物質，能量供應的不充分是導致結腸炎的主要因素之一，而結腸上皮細胞70% 能量一般是從丁酸鹽中獲得，葡聚糖硫酸酯能抑制丁酸氧化而對葡萄糖代謝沒有影響，通過對老鼠口服葡聚糖硫酸酯便引發(fā)結腸炎。存在于腸上皮細胞的TOLL-樣受體能識別諸多細菌及細菌產物并被其激活，丁酸梭菌激活的是TOLL-樣受體2（TLR2）調節(jié)的骨髓分化因子88（MyD88）的非依賴性途徑，即TLR2 接受刺激后導致適量NF-κB、IL-8、IL-6 及TNF-α 的分泌，以抵抗病原菌的感染且防止了自身免疫紊亂，而非依賴于MyD88 激活NF-κB，進而導致IL-8、IL-6 及TNF-α 的過度分泌。丁酸具有抗炎癥效應，體現在能改變腸道pH 而抑制部分NF-κB 轉移因子的活力，自然降低炎癥細胞因子（IL-8、IL-6）的過度表達。丁酸鹽還具有促進癌細胞凋亡和在體外抑制癌細胞的增殖，從而在體內發(fā)揮抵抗癌癥的積極作用。從丁酸梭菌中抽提并純化的脂磷壁酸，能抑制拜氏梭菌和大腸桿菌對人結腸癌細胞以及腸道細胞的黏附，從其芽孢中分離的脂質部分能一定程度的抑制白血病淋巴細胞、胸腺癌和肺癌細胞中尿激酶的合成。Arimochi 等利用丁酸梭菌發(fā)酵大豆蛋白，發(fā)酵液中存在著誘導細胞凋亡的物質且能在體外誘導HCT116 結腸癌細胞的死亡，從而得出腸道菌能夠利用食物源性蛋白產生抗腫瘤物質的結論。
丁酸梭菌還產生乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸，培養(yǎng)基中添加1% 的抗性淀粉時，丁酸梭菌產生的乙酸、丙酸、丁酸的摩爾比為1.8∶1∶1。在胃腸道中，短鏈脂肪酸在產生部位直接被吸收，同時刺激腸道蠕動，改善腸道微環(huán)境，調節(jié)微生態(tài)平衡，治療相關疾病。丁酸梭菌產生的氨基酸、B 族維生素和維生素K，能促進VE 的吸收，補充必要的營養(yǎng)物質；分泌淀粉酶、糖苷酶以及降解飼料的果膠酶、葡聚糖酶，產生促雙歧桿菌發(fā)育的因子，同有益菌群共生，對機體產生各種保健功能。丁酸梭菌還能分解胺類、吲哚類、硫化氫等有害物質，減少癌癥的發(fā)生率和改善糞便的惡臭，從而提高健康質量和改善環(huán)境。
此外，在臨床應用方面，丁酸梭菌制劑或與其他益生菌、中藥提取物和抗生素聯(lián)合使用，能有效的治療腹瀉、腸炎、腸易激綜合癥和新生兒黃疸、手足口病等諸多疾病，且療效顯著。在再生能源開發(fā)方面，因丁酸梭菌可發(fā)酵碳水化合物產氫氣而備受關注。Plangklang 等利用甘蔗渣做支撐材料固定丁酸梭菌，使發(fā)酵甘蔗汁產氫氣的速率提高了20%，最佳優(yōu)化條件下每消耗1 mol 己糖便產生1.52mol 氫氣。丁酸梭菌還是生產1，3-丙二醇很好的發(fā)酵菌，產生的1，3-丙二醇被良好的用于生產輕化工產品。
2丁酸梭菌發(fā)酵工藝研究進展
在丁酸梭菌的液態(tài)培養(yǎng)方面，戚薇等采用單因素和正交試驗優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基組成為（g/L）：胰蛋白胨10，葡萄糖8，酵母膏4。于37℃培養(yǎng)24 h，活菌數可達4.1×108 CFU/mL，培養(yǎng)基中添加K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L，培養(yǎng)32 h，活菌數芽孢轉化率可達95%，也簡化了培養(yǎng)基成分。其中，最經濟的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基被確定為每升培養(yǎng)液中含有8 g 葡萄糖、20 g 豆粕（中性蛋白酶水解3 h）和5 g 啤酒酵母粉，最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，丁酸梭菌活菌數可達8×108 CFU/mL，使成本降低了90%。至于固態(tài)發(fā)酵技術的應用，王海寬等在丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵方面已經獲得了授權專利，丁酸梭菌活菌數大于1.0×109 CFU/g。
此外，Hakalehto 等發(fā)現CO2 是梭狀芽孢桿菌生長的一個必要的信號，在丁酸梭菌的純培養(yǎng)過程中，外部環(huán)境中沒有CO2 將導致其生長的大量延遲或難以啟動；丁酸梭菌與短乳桿菌存在著共生關系，同時短乳桿菌產生的CO2 能夠更好地啟動丁酸梭菌的生長。亦有學者利用丁酸梭菌跟鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌混合培養(yǎng)來制備丁酸梭菌復合制劑，并將其作為醫(yī)藥和飼料添加劑應用于人類和養(yǎng)殖動物。
3丁酸梭菌在臨床上的應用
60 多年前，日本就已經實現了丁酸梭菌的商業(yè)化生產，自此，丁酸梭菌先后被用作人用處方藥、非處方藥、獸藥、飼料添加劑及保健食品等，且丁酸梭菌制劑在國內外臨床應用已有幾十年的歷史。
我國對丁酸梭菌作為益生菌劑的研究起步于20 世紀90 年代，經過20 余年的動物試驗以及臨床上的應用，證實丁酸梭菌的急性毒素實驗和艾姆斯試驗均呈安全性，丁酸梭菌制劑能有效治療嬰幼兒功能不健全、正常菌群失調、腸易激綜合癥和輔助治療鵝口瘡、反復呼吸道感染、手足口病等相關疾病，以及放療和化療造成的免疫功能下降。
2004 年，青島某公司研發(fā)的丁酸梭菌制劑被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準為新藥，2005 年3 月，口服丁酸梭菌膠囊、片劑和散劑的生產通過了國家食品和藥品監(jiān)督管理局的GMP 認證，隨后作為非處方藥全面上市，使中國成為第二個實現丁酸梭菌制劑產業(yè)化的國家。
3.1 嬰幼兒功能不健全相關疾病
人腸道菌群的建立始于新生兒被分娩的過程，出生后的嬰兒則從母親的皮膚及乳汁、身邊的物體、周圍的空氣等環(huán)境中得到細菌“種子”，而某些“種子”的缺乏將導致微生態(tài)調節(jié)機制不健全，同時由于新生兒機體功能不健全，諸如兒童營養(yǎng)不良、早產兒喂養(yǎng)不耐受、新生兒高膽紅素血癥等相關疾病具有較高的發(fā)病率。
丁酸梭菌在防治早產兒喂養(yǎng)不耐受和治療兒童營養(yǎng)不良的臨床應用，證實了丁酸梭菌活菌散能加速腸黏膜上皮細胞的生長和早產兒腸道發(fā)育成熟，促進腸蠕動，恢復腸動力；產生多種消化酶和葉酸、B 族維生素等，促進食物的消化、吸收和補充營養(yǎng)物質從而有效的治療兒童營養(yǎng)不良和早產兒喂養(yǎng)不耐受。在預防治療新生兒黃疸中，丁酸梭菌產生的丁酸，降低了β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，競爭性地阻止結合膽紅素分解為非結合膽紅素，減少肝腸循環(huán)，同時促進腸蠕動加快，促進排便，增加膽紅素的排泄，從而有效的（P<0.05）減輕新生兒黃疸的程度、降低高膽紅素血癥的發(fā)生率。
3.2 正常菌群失調的相關疾病
由于宿主的神經性、功能性或器質性的改變，或致病性細菌、病毒乃至霉菌的入侵，或服用抗菌藥物等都會導致正常菌群失調而引起小兒急性腹瀉、小兒秋冬季腹瀉、繼發(fā)性腹瀉、病毒性腹瀉、抗生素相關性腹瀉、腸易激綜合癥等相關疾病；腸道有害菌移位產生的內源性感染，先天性免疫失調引發(fā)的免疫紊亂等，都將導致腸道局部黏膜受損，進而引發(fā)相關的腸道炎癥（慢性末端回腸炎、潰爛性結腸炎和壞死性小腸結腸炎等），而丁酸梭菌產生的丁酸能抑制去乙酰化酶活性、產生的葉酸參與基因的甲基化和去甲基化，調節(jié)宿主的基因表達，從而預防和治療腸炎、腸癌。
目前，丁酸梭菌制劑的臨床應用于治療正常菌群失調引起的相關疾病的療效顯著，具有統(tǒng)計學意義，且無不良反應。抗生素相關性腹瀉是幽門螺桿菌根治治療過程中導致腸道微生態(tài)功能失調的副作用，而在幽門螺桿菌根治治療過程的同時，服用一定劑量的丁酸梭菌制劑，結果在治療組未發(fā)現腹瀉的情況，亦沒有檢測到艱難梭菌毒素A。丁酸梭菌制劑治療慢性末端回腸炎療效顯著（有效率97.5%），大便性狀、腹部疼痛、腸鳴音得到明顯改善，其機理是TOLL-樣受體4 能夠識別丁酸梭菌導致IL-10 的分泌，而IL-10 在抵消機體過度免疫應答方面起重要作用，丁酸梭菌產生的丁酸能加強腸黏膜的能量、營養(yǎng)代謝，抑制炎癥因子的過度表達，修復胃黏膜，提高機體免疫。
3.3 輔助治療
鵝口瘡、反復呼吸道感染、手足口病等疾病是由致病性微生物等直接引起的疾病，在常規(guī)臨床治療的同時利用丁酸梭菌制劑進行輔助治療，頗具成效，形成了新的治療理念。
鵝口瘡是兒科常見多發(fā)病癥，是由念珠菌感染引起的口腔黏膜急性假膜性損害，甚至引起念珠菌性食道炎或肺念珠菌病，出現呼吸困難而危機生命，但常規(guī)治療后短期易復發(fā)。鄒積茹等現丁酸梭菌制劑能夠促進腸黏膜大量分泌免疫球蛋白sIgA，sIgA 是黏膜免疫的主要抗體并可經血液循環(huán)到達口腔黏膜，丁酸梭菌還能促進巨噬細胞的功能以增強細胞免疫，聯(lián)合制霉菌素對鵝口瘡進行治療，治療結果顯著，且復發(fā)率大大降低（P<0.05），丁酸梭菌活菌散與制霉菌素片聯(lián)用治療嬰幼兒鵝口瘡是一種理想的選擇，值得臨床推廣應用。
反復呼吸道感染是小兒常見病，發(fā)病率達20%左右。張永紅等證實丁酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌散對反復呼吸道感染尤其是反復上呼吸道感染具有預防和治療作用，發(fā)熱時間、咳嗽緩解時間、咽和扁桃體紅腫消退時間以及肺部濕啰音消失時間都顯著短于對照組（P<0.05），可作為兒科臨床上反復呼吸道感染患兒的一種治療選擇。手足口病是由腸道病毒引發(fā)，病毒在腸黏膜內繁殖并持續(xù)釋放到血液，當利用丁酸梭菌制劑輔助治療手足口病時，患兒的皰疹消失時間、體溫恢復正常時間均明顯短于對照組。丁酸梭菌制劑具有抑制病毒代謝、繁殖和促進機體細胞免疫、體液免疫等功效，為手足口病提供了一種新的治療方法。
4動物飼料中應用
食物傳染疾病的爆發(fā)強調了減少動物器官食物中病原菌的必要性，動物腸內病原菌是食物污染的直接來源，世界對抗生素抗性基因能夠從動物轉移到人類的廣泛關注，導致歐盟決定自2006 年1 月1日禁止使用抗生素作為生長促進劑。丁酸梭菌制劑成為替代抗生素的一種理想選擇，既能減少抗生素的使用所引起的抗藥性、二重感染等，又能提高動物的自然防御機制和經濟效益。我國農業(yè)部已于2009 年7 月批注了丁酸梭菌制劑作為微生物飼料添加劑的使用。
4.1 作為動物益生菌制劑
在韓國，丁酸梭菌制劑已經被用于牛、豬和家禽的飼料添加劑。國內諸多研究證實丁酸梭菌發(fā)酵能夠使飼料酸化軟化，提高營養(yǎng)物質和適口性；在動物體內以絕對優(yōu)勢搶占空間生態(tài)位和營養(yǎng)生態(tài)位，產生多種益生物質，提高飼料利用率；保持動物腸道內微生物菌群正常化，產生丁酸梭菌素，抑制腸道有害菌，提高動物抗病力、免疫力，減少死淘率以及降低糞便中NH3、H2S 的含量，但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動物飼料。孫梅等最新研究成果是采用微膠囊化包埋丁酸梭菌，以提高丁酸梭菌作為飼料添加劑的使用效果。經研究確定丁酸梭菌在采用4% 的海藻酸鈉和2% 的明膠混合物作為壁材的包埋劑中活菌數能增殖至4.9×109 CFU/mL， 包埋率達99.5%。微膠囊顆粒具備良好的穩(wěn)定性、耐熱性、腸溶性，耐酸性及耐膽鹽性試驗前后活菌數量差異不顯著（P>0.05），但耐胃酸及耐膽鹽較未包埋的對照組有顯著提高。最終為微膠囊化丁酸梭菌作為飼料添加劑的實際應用奠定一定的理論基礎。
4.2 改善動物的生產性能
丁酸梭菌制劑能減少動物飼料中抗生素、類激素類物質的使用，改善動物的生產性能，提高禽畜肉蛋奶制品產量和魚類的受精率、產卵量、孵化率及魚苗成活率。家禽腸道絨毛的長度與其腸上皮細胞數量呈顯著正相關。當絨毛變長時，腸上皮細胞數增多，對營養(yǎng)物質的消化吸收能力增高。在1 日齡AA 肉雞中添加0.9% 丁酸梭菌能顯著提高腸道絨毛長度，從而也能顯著提高肉雞平均日增重量，且試驗組的發(fā)病率和死淘率均顯著低于對照組。在肉雞的飼料中添加適量的丁酸梭菌，盲腸消化物的pH 和盲腸的相對長度降低顯著，空腸黏膜上的堿性磷酸酶活性以及盲腸中的短鏈脂肪酸相對增加，暗示食用油和丁酸梭菌相互作用對肉雞腸道產生了健康的影響。
丁酸梭菌制劑可以顯著提高種鴨蛋的受精率。機理是丁酸梭菌在腸道內可產生多種維生素和酶等物質，有助于促使種番鴨對鈣、磷、錳、鋅、銅和鐵等的吸收，滿足種番鴨繁殖性能的需要，提高種公鴨的精液品質及種蛋的受精率，又避免了使用抗生素而產生的種種弊端。
4.3 改善動物產品質量
丁酸梭菌制劑能調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡以及治療相關動物疾病，有效地減少二重感染和動物體內的藥物殘留；增加血中蛋白氮的含量，改善蛋白質的代謝，能降低血清中的膽固醇水平；產生各種益生物質，利于補充必需的營養(yǎng)，維持機體正常生理功能，促進代謝，改善畜禽漁產品質量，進而保證畜禽漁產品的質量符合生產、加工、銷售及出口的標準，以沖破國際貿易上的“綠色壁壘”。
當肉雞的飼料中添加一定劑量的丁酸梭菌時，肉雞腹部脂肪中的脂蛋白脂肪酶活力、空腸黏膜中肝型脂肪酸結合蛋白基因的表達、胸肌中的十二碳五烯酸和n-3 不飽和脂肪酸的含量均增加顯著（P<0.05），同時肌肉的剪切力明顯降低，而對于胸肌中的滴水損失，飲食中的油脂（魚油）和丁酸梭菌存在著極顯著（P<0.01）的交互作用，有力地證明丁酸梭菌能夠改善肉制品的質量和提高胸部肌肉中必要的不飽和脂肪酸含量。
5展望
丁酸梭菌制劑作為新一代的芽孢益生菌劑，具備良好的生理、生化特性，較非芽孢益生菌劑耐儲存、活菌數穩(wěn)定，且能與抗生素聯(lián)合使用。但丁酸梭菌的發(fā)酵需嚴格的厭氧條件，對培養(yǎng)基成分及設備要求較高，故低成本的發(fā)酵工藝仍待深入研究。隨著丁酸梭菌與其他益生菌共生關系的建立，利用固態(tài)混菌發(fā)酵技術生產丁酸梭菌制劑具有培養(yǎng)基簡單且來源廣泛、投資少、能耗低、污染環(huán)境較少等優(yōu)點，較液態(tài)純培養(yǎng)具諸多優(yōu)勢，這將使丁酸梭菌益生菌制劑的大規(guī)模制備成為可能。
在動物飼料中的應用方面，為確保經濟效益、產品的質量和減少抗生素的使用，應進一步提高丁酸梭菌在胃腸道內的活性研究和加強其在飼料加工過程中對多種外加條件的承受能力，在此基礎之上研究生產高效穩(wěn)定的丁酸梭菌制劑及生產工藝；在飼料制備過程中，應關注與其他菌的共生發(fā)酵，以提高飼料的適口性、營養(yǎng)、轉化率和降低成本，同時，需研究丁酸梭菌與其他藥物的協(xié)同作用，目的在于有效治療動物疾病、降低死亡率。再者，當針對不同的動物和不同的生長階段，添加不同劑量的丁酸梭菌制劑，以保證在畜牧業(yè)、禽業(yè)、漁業(yè)等方面發(fā)揮其最大的作用。
在臨床應用方面，丁酸梭菌及其代謝產物具有重要的生理功能，對人和動物的健康產生各種影響且效果顯著，然而其中諸多有利于健康的影響并非決定性的，丁酸梭菌及其代謝產物的作用機制、益生原理有待于深入研究，尤其是在維持微生態(tài)平衡、治療炎癥和癌癥方面，為丁酸梭菌制劑的應用提供必要的理論依據。另一方面，不同的益生菌各有其功效，丁酸梭菌對多種抗生素具有很強的耐藥性，其與其他益生菌、益生素在體外或體內的協(xié)同作用有待于發(fā)現。此外，丁酸梭菌的其他功效以及與新技術的結合更有待于研究。
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