菌酶協同發酵對玉米的研究表明可提高蛋白的消化性,改善口感
玉米蛋白粉是玉米淀粉濕法加工的主要副產物,蛋白質含量約占60%左右,富含各種氨基酸,如丙氨酸、絲氨酸和亮氨酸。具有脂溶性蛋白質含量高、氨基酸不平衡、必需氨基酸含量低、消化性差等缺陷。
玉米蛋白粉作為一種高蛋白飼料原料,在動物生產中的應用也愈發廣泛,然而動物采食后難以被胃、腸道吸收利用,導致玉米蛋白粉的利用效果較差。因此,提高玉米蛋白粉的有效利用率,適宜的預處理顯得尤為重要。酶法改性是一種有效的手段,該方法可以有效降低玉米蛋白粉中的抗營養因子產生,從而增加底物的水解度和消化性,但酶解會促使玉米蛋白粉產生苦澀味道,影響口感,且存在耐熱性差等問題。微生物發酵也能夠提高蛋白質的利用率,發酵過程中產生的酶可以酶解底物中的大分子物質,降低抗營養因子的抗原性,并通過產生有機酸和抑菌物質發揮其抑菌活性,但微生物發酵存在菌株性能不穩定、耐受性低的問題。將兩種改性方法進行有機結合,微生物發酵能夠產生相應功能酶,與體系內酶發揮協同作用,共同促進底物酵解過程,顯著縮短發酵周期,從而使底物分解成更易吸收的小肽。
研究表明菌酶協同發酵小米可以有效提高小米蛋白的消化性,改善口感。研究發現微生物發酵和酶水解預處理可以使玉米蛋白粉的蛋白結構發生改變,并且可以改善氨基酸平衡及動物的吸收和利用。研究發現微生物的繁殖和代謝的過程可抑制抗營養因子的產生,進而提高蛋白的可消化性。發現微生物發酵過程中會引進有機酸,使胃消化環境pH降低,胃蛋白酶活性升高,蛋白消化率升高。
因此,為進一步提高玉米蛋白粉的消化性,研究以玉米蛋白粉為原料,將乳酸菌發酵與酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解結合,采用單因素、正交試驗確定最佳發酵工藝條件,并對直接影響玉米蛋白粉體外消化性的游離巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性、氨基酸等理化特性進行分析,以獲得更高消化性的菌酶協同發酵產物,為菌酶協同發酵玉米蛋白粉提供技術支撐,并為玉米蛋白粉的生產加工和開發利用提供理論依據。
材料與方法
1.1材料與試劑
乳酸菌(活力為×1010 CFU/g)、酸性蛋白酶(活力為20 000 U/g、木瓜蛋白酶(活力為10
000 U/g),玉米蛋白粉(蛋白質含量66%)。
1.2設備與儀器
ME104E電子天平;ZNCL-GS磁力加熱攪拌器;RF5301PC熒光分光光度計,TU-1810紫外可見分光光度計,3-18KS臺式高速冷凍離心機。
1.3試驗方法
1.3.1復合酶酶解產物的制備
通過試驗預處理,將玉米蛋白粉進行木瓜蛋白酶(添加量400 U/g、溫度55℃、pH 6.0、時間3h)及酸性蛋白酶(溫度40℃、添加量800 U/g、pH 3.0、時間3h)復合處理得到復合酶酶解產物。
1.3.2乳酸菌發酵復合酶酶解產物
利用乳酸菌發酵上述復合酶酶解產物,考察發酵溫度( 33~41℃)、接種量(0.1 %~0.5%,質量分數)、料液比(1:2~1:6,g/mL)、發酵時間(12~36 h)對產物水溶性蛋白質含量的影響。
1.3.3福林酚法測水溶性蛋白
參照文獻采用福林酚法測定產物水溶性蛋白質含量。吸取0.2mL的玉米蛋白粉水解液,加入0.8mL蒸餾水、5mL福林酚甲液,混勻10 min,再加入0.5mL稀釋1倍的福林酚乙液,混勻并水浴(30℃、30 min)。然后用紫外分光光度計在最適波長處進行測定(640nm)按公式(1)計算水溶性蛋白質含量。
1.3.4游離巰基含量的測定
參考方法并進行適當的修改。稱取400 mg不同改性產物添加量的凍干樣品于10mL的0.2mol/L Tris-Gly緩沖溶液中,渦旋振蕩5 min,離心機離心(5 000 r/min、15 min。取4mL上清液與0.1mL 10mmol/L的DTNB溶液混勻,靜置20 min,用紫外分光光度計在412nm波長處進行測定,按公式(2)計算游離巰基的含量。
式中:n,標準曲線縱坐標游離巰基含量,μmol/mL;c,樣品濃度,g/mL; SHF,游離巰基的含量,μmol/mL。
1.3.5二硫鍵含量的測定
取1.3.4中離心后的上清液1mL,加入0.1mL β-巰基乙醇和4mL的0.2mol/L Tris-Gly緩沖溶液,常溫顯色1h,然后添加10mL 12%的三氯乙酸,均勻混合1h,高速離心機離心(4 500 r/min ,15 min,保留沉淀,用5mL 12%的三氯乙酸溶液洗滌沉淀2次,洗滌完全后溶于10mL 0.2mol/L的Tris-Gly緩沖溶液,溶解后加入0.1mL 10mmol/L DTNB,靜止20 min,用紫外分光光度計在412nm處測定吸光度后,按公式(3)和公式(4)計算總巰基含量。
式中:n,吸光度經標準曲線計算出的巰基含量,μmol/mL;c,樣品濃度,g/mL;V1,上清液體積,mL;V2,沉淀復溶后體積,mL。
式中:SHT,總巰基含量,μmol/mL ;S HF,游離巰基含量,μmol/mL。
1.3.6表面疏水性的測定
以10mmol/L PB S溶液,pH為7.0配制蛋白溶液(0.05,0.10,0.15,0.20,0.25mg/mL)
取2mL稀釋液加入10μL ANS溶液(8.0mmol/L)中,并用熒光分光分度計激發波長為390nm、發射波長為470nm進行測定,以熒光強度隨蛋白濃度變化的斜率表示表面疏水性。
1.3.7氨基酸組成分析
參照方法,使用氨基酸自動分析儀進行分析。
1.3.8體外消化率測定
采用體外胃-胰蛋白酶兩步法測定菌酶協同發酵產物。稱取10%濃度的樣品于具塞三角瓶,調節pH值至2.0,加入30 mg的胃蛋白酶,用水浴搖床以39℃、120 r/min條件下振蕩4h。調節pH值至7.5,加入30 mg的胰蛋白酶,再振蕩3 h,取10mL消化液添加至15%三氯乙酸中,搖勻后靜止30 min,4 000xg離心10 min。取上清液2g于消化管,凱氏定氮法測定上清液的含氮量,每個樣品設置3個平行。如公式(5)所示:
結果與分析
2.1 乳酸菌發酵復合酶酶解產物
2.1.1乳酸菌發酵復合酶酶解產物單因素試驗
以乳酸菌發酵的發酵溫度、接種量、時間、料液比為試驗因素,考察各因素對菌酶協同發酵產物水溶性蛋白質含量的影響,結果見圖1。
由圖1-a可知,隨著溫度升高,水溶性蛋白質含量整體趨勢為先升高再降低,在37℃時水溶性蛋白質含量達到最大值。這是因為在37℃時乳酸菌生物活性最高。當溫度不在該最適溫度范圍,乳酸菌的生物活性減弱,直接影響乳酸菌的發酵性能。
由圖1-b可知,隨著接種量的增加,水溶性蛋白質含量呈先升高后降低趨勢,這是因為接種量會影響發酵體系內微生物的生長繁殖,隨著接種量逐漸升高,發酵體系內微生物生長茂盛,從而使產生的水溶性蛋白質含量升高;而接種量過多會使發酵環境中菌與底物比過高,發酵環境中營養物質消耗殆盡,還有可能會產生發酵代謝物,導致發酵環境中產生有毒代謝成分。因此選擇適宜接種量為0.4%(質量分數)。
由圖1-c可知,隨著發酵時間的延長,水溶性蛋白質含量升高,當發酵時間為24 h時,水溶性蛋白質含量達到最高。原因是短時間的發酵不能使玉米蛋白粉發酵完全;而發酵時間過長,底物隨時間的延長而消耗完全,并且發酵產物過多會抑制反應的進行,導致乳酸菌的衰亡。因此選用發酵時間24 h。
由圖1-d可知,當料液比在1:2~1:4 ( g/mL)時,水溶性蛋白質含量逐漸升高,在1:4~1:6
(g/mL)時,水溶性蛋白含量逐漸降低。這是因為水分含量的多少會影響乳酸菌的生長,水分含量過低時不利于乳酸菌的生長繁殖;過高時會促進有害菌(梭菌)發酵,抑制乳酸菌生長。因此發酵料液比選用1:4(g/mL)。
2.1.2正交試驗設計
在單因素的基礎上,采用L9(34)正交表優化乳酸菌發酵復合酶酶解產物的發酵條件。正交因素水平表如表1所示,正交試驗結果如表2所示,方差分析結果如表3所示。
由表2可知,以水溶性蛋白質含量為評價指標,影響極差R大小的主次順序依次為C>B>A>D,即料液比>加菌量>時間>溫度。理論適宜組合為A2B1C2D3。即:發酵時間為24 h,發酵接種量為0.3%(質量分數),發酵料液比為1:4(g/mL),發酵溫度為39℃。
由表3可以看出,料液比對水溶性蛋白質含量影響差異顯著。將理論適宜因素水平下進行驗證試驗,水溶性蛋白質含量為15.9 mg/mL,略高于已報道的玉米蛋白粉飼料發酵工藝中水溶性蛋白質含量(13.77 mg/mL),且有效的縮短了發酵時間。因此,乳酸菌發酵復合酶酶解產物最佳工藝條件為:發酵時間為24 h,發酵接種量為0.3 %(質量分數),料液比為1:4 C g/mL,發酵溫度為39℃。
2.2菌酶協同發酵對玉米蛋白粉游離巰基、二硫鍵及表面疏水性含量的影響
菌酶協同發酵對玉米蛋白粉的游離巰基、二硫鍵和表面疏水性的影響如圖2所示。
巰基和二硫鍵是反映玉米蛋白品質變化的一個重要指標。由圖2-a可知菌酶協同發酵產物的游離巰基含量由65.43μmol/g升高至88.42μmol/g,二硫鍵含量由67.06μmol/g降低至38.32μmol/g,這是因為菌酶協同發酵會使玉米蛋白粉的空間結構發生改變,使連接肽鏈之間的二硫鍵打開,導致游離巰基含量上升,玉米蛋白的空間結構松散,蛋白消化率發生改變。
由圖2-b可知經菌酶協同發酵后的產物表面疏水性由71.94降低至10.97。這是因為菌酶協同發酵可以打開蛋白質的三、四級空間結構,促使酶與酶切位點結合,剪切長肽鏈,導致親水基團從內部暴露出來,蛋白表面疏水性降低。
2.3菌酶協同發酵對玉米蛋白粉氨基酸組成分析
菌酶協同發酵對玉米蛋白粉的氨基酸分析如表4所示。
氨基酸是消化能力的大小的重要影響因素,發酵可使產物的氨基酸組成與原蛋白相比發生明顯變化。菌酶協同發酵玉米蛋白粉氨基酸含量由表4可知,菌酶協同發酵產物中的氨基酸組成豐富,含15種不同氨基酸,含有蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等6種必需氨基酸。其中必需氨基酸含量為22.54、23.56、25.70 mg/g,總氨基酸含量分別為64.56、66.91、72.27mg/g。
此外,菌酶協同發酵產物與玉米蛋白粉相比,必需氨基酸含量升高3.16 mg/g,總氨基酸含量升高7.71 mg/g,親水氨基酸含量從32.19 mg/g升高至35.25 mg/g。這主要是因為玉米蛋白中多為不溶性的玉米醇溶蛋白,蛋白表面含有大量的疏水性氨基酸,且以二硫鍵和氫鍵維持其結構穩定。本研究利用復合酶酶解或者菌酶協同發酵玉米蛋白粉,一方面破壞了二硫鍵(見2.2二硫鍵含量分析結果)和氫鍵,導致醇溶蛋白表面疏水氨基酸含量減少,從而有利于暴露內部親水性氨基酸;一方面,被破壞的疏水性氨基酸又在體系內形成更多新的氨基酸,從而使總氨基酸含量上升。已有研究表明提高親水氨基酸的含量可提高蛋白質在體內的消化率。由此可知,菌酶協同發酵玉米蛋白粉產物的氨基酸較平衡,消化性能好。
2.4菌酶協同發酵產物的體外消化率分析
菌酶協同發酵玉米蛋白粉的體外消化率如圖3所示。
體外消化率可表征營養物質在體內被消化利用的是否完全,還與微生物對飼料的作用能力有關。體外消化率直接可反映采食量和飼料可消化性。由圖3可知,菌酶協同發酵可以提高玉米蛋白粉的體外消化率,由60.15%(玉米蛋白粉)升高至80.42 %,高于已有報道利用單一發酵所得玉米蛋白粉的消化率(67.10%)。這是因為蛋白原料的空間結構直接影響消化率。研究表明蛋白質疏水作用減弱、二硫鍵斷裂、游離巰基含量上升,會使體外蛋白消化率升高。而由2.2可知,菌酶協同發酵玉米蛋白粉使疏水作用和二硫鍵顯著下降,游離巰基含量顯著上升,綜上所述,菌酶協同發酵玉米蛋白粉會使體外消化率顯著升高。
結論與討論
菌酶協同發酵使玉米蛋白粉的二硫鍵含量、表面疏水性降低,游離巰基、氨基酸含量升高,從而顯著提高玉米蛋白粉的體外消化率(由60.15%升高至80.42%)。同時,本研究成果為菌酶協同發酵玉米蛋白粉在飼料中的應用提供理論基礎,也可為菌酶協同發酵玉米蛋白粉提供技術支撐。
二十余年酶菌結合發酵經驗積累,更輕易成功以高濃度乳酸菌為主的酶菌結合生物飼料發酵劑,簡單好用的中草藥發酵劑,在2022年6月再次升級添加了増香增甜菌種,功能更強效果更好,但運用成本更低。
特別提醒:根據不同物料本品1包可以發酵1-5噸飼料,如果是第一次制作發酵飼料、需要發酵的原料霉變或變質較重、發酵環境溫度較低(低于15℃)、粗纖維較高、需要加快發酵速度或者需要制作出更加香醇高品質的生物發酵飼料出來等情況,請按照本產品說明書使用量增加2-3倍的使用量即可。
(南寧微瑞生物科技有限公司是廣西助農畜牧科技有限公司的直屬下屬公司)
【產品特點】
1.本產品采用以高濃度乳酸菌(300億/g)為主要原料,結合了復合益生菌、酶制劑、酸化劑的諸多優點,能夠發酵處理各種飼料原料、青綠飼料、秸稈粗飼料、各類食品加工下腳料糟渣等成為營養豐富的飼料,且能夠降解飼料中的抗營養因子,提高飼料在動物腸道中的消化吸收利用率,是降低飼料成本、改善動物肉品質、改善養殖場環境(臭味氨氣下降非常明顯)的好方案,使用后養殖環境形成益生菌環境,對動物健康有較好的保健作用。
2.對霉變飼料及飼料原料具有脫霉作用,霉菌在厭氧發酵環境中無法生存,達到脫霉效果;對棉菜粕具有脫毒作用,通過酶制劑對抗營養因子的分解,并在發酵的過程中產生小肽。
3.產品中另外添加了新型增甜增香菌種,明顯改善發酵料的適口性,使得處理后的發酵料增香增甜,動物對發酵料更愛吃。
4.客戶鑒別本產品真假和一些發酵劑產品比較效果的簡單方法:500~600毫升的空塑料瓶裝入50克大米,倒入300毫升不超過40℃的干凈溫水,加入本品2-5克,蓋上蓋子搖動一下后放在溫度30℃左右環境中每天幾次小心放氣,2~3天大米基本溶解成乳狀。假冒發酵劑幾乎不能溶解大米(也就是分解效果差),無大氣體產生、發酵速度慢和香甜度差等,效果對比一目了然。
【產品使用方法】
一、制作液體菌液(保健菌液與加強型EM菌液)
將本品1包和200克紅糖溶于20公斤的溫水中(不高于45℃)密封發酵72小時以上(注意放氣安全),就成為酶菌結合的益生保健菌液(加強型EM菌)要求長期密封保存一年以上有效,長期在畜禽水產養殖動物上按照飼料重量的0.3%-0.5%拌入飼料中飼喂,飲水按照0.2%添加,動物會非常喜吃,動物各階段(包括孕畜)均可長期使用。也可以用液體菌液制作青貯飼料,每噸青貯飼料中加入液體菌液1-2公斤即可。
二、處理全價或自配飼料成無抗飼料
本品1包(500克)與全價顆粒飼料1000公斤(可以加入中草藥20公斤效果更好),清水600公斤,混勻后放入陶瓷或者塑料桶中嚴格密封,3天后開始使用。使用時發酵的全價飼料10%-20%,未發酵的全價飼料80%-90%,周圍疫情高發期發酵的全價飼料增加到20%-30%,使用后具有明顯的保健效果與提高消化降低料耗的作用。
→長期在豬飼料中添加部分發酵全價飼料對比效果明顯;→長期飼喂部分發酵全價飼料對豬生長、糞便臭味物質、血清抗氧化及免疫性能指標的影響
三、發酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、工廠學校剩飯、米糠、統糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青秸稈、牧草、紅薯藤等原料
本品0.5-1包與1噸待發酵原料(部分原料需要粉碎),含淀粉類的飼料100公斤(比例約為原料的5%以上,如玉米、大米、紅薯、淀粉均可,也可以用3公斤以上多糖性復合菌種營養基代替)、食鹽2公斤(含有足量食鹽的原料則不添加,食鹽不能放在激活的菌種中,要直接撒在發酵料上或需要添加的清水中,下同)。含水量調節到55%-60%左右,壓實密封發酵7天左右有濃郁香味時即可使用。發酵后的料適口性、營養、消化率較未發酵前有明顯提升。發酵后的飼料根據不同動物與不同飼養周期按照10%-50%與該動物其他全價飼料混合后飼喂,不可以單獨飼喂或全部飼喂發酵飼料。
四、霉變的飼料及飼料原料脫霉
每1噸霉變飼料或飼料原料添加本品1-2包、玉米粉400公斤(霉變原料中含有能量飼料如玉米粉、小麥粉等20%以上可無需另外添加玉米粉,也可以用5公斤以上多糖性復合菌種營養基代替),均勻混合后將物料含水量調節至60%左右,密封發酵7-15天后(夏短冬長,氣溫低于15度時建議在室內進行保溫發酵),發酵料有濃郁甜酒香味即可使用。脫霉后的飼料按照飼料比例的30%左右與飼養動物的全價飼料混合后飼喂,不可以單獨飼喂。
五、對棉粕、菜粕、菜粕、棕櫚粕、花生枯、茶枯的脫毒與生成小肽
本品0.5-1包、1噸待發酵原料、玉米粉100公斤(也可以用3公斤以上多糖性復合菌種營養基代替)、食鹽2公斤。含水量調節到55%左右密封發酵一周以上。本產品不僅能夠快速去除棉粕、菜粕、菜粕、棕櫚粕等其中的抗營養因子(俗稱其中的毒素),形成生物蛋白飼料代替豆粕提高消化吸收率,還能夠在發酵過程中生成大量對動物有益的的小肽。
六、中草藥及中藥渣發酵方法
1.固態中草藥發酵技術:將100公斤中草藥粉碎,越細越好放入80公斤的35℃左右的溫水中,加入玉米粉與豆粕各10公斤、本品1包、食鹽200克,放入塑料容器內壓實密封發酵7天以上后使用,密封可以保存一年以上,按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。
2.液態中草藥發酵技術(即發酵成為中草藥活菌水的方法):1-2公斤中草藥(如“御瘟湯”)+1包本品+10公斤全價飼料(可以用750克以上多糖性復合菌種營養基或2公斤以上紅糖代替)+100公斤清水混合在非金屬容器中簡單密封發酵72小時以上后使用(在半個月內使用完效果更好,且要持續密封保存,否則時間一長可能變質不能使用)。按照5%-10%的比例添加到動物飼料中飼喂,或2%-5%的比例添加的動物飲水中飼喂。
3.中藥渣發酵:中藥渣1立方,本品1包、玉米粉100公斤(也可以用3公斤以上多糖性復合菌種營養基代替)、豆粕50公斤(花生粕、菜粕、茶粕等均可),食鹽3公斤,混合含水量調節在55%-60%左右,裝入大容器或薄膜袋中壓實密封發酵,一般一周左右有濃郁的甜酒香味即可使用,密封可以保存一年以上。發酵后的中藥渣按5%以上的比例添加到飼料中。
非洲豬瘟防控期間運用這個方法更好——豬場復養增加自制發酵中草藥體內外運用能夠輕易成功,實施容易成本低,幾乎不會失敗
七、制作輕度全量發酵飼料及水料上的運用
本品0.5-1包、全價飼料1000公斤、清水600-800公斤混合發酵6-24小時后飼喂,形成輕度全量發酵預消化模式;或者清水增加到1500公斤以上形成水料發酵24小時內飼喂,兩種模式能夠達到更好的消化吸收率。
八、制作優質的青貯飼料
每噸青貯飼料中加入液體菌液2公斤即可,能夠加速發酵、提高質量和適口性,且不容易失敗還能夠更長時間保存。
【配料說明和注意事項】
1、將本品放入約20倍的溫水中化開2-24小時活化后再使用效果更好;在發酵物料時一定要壓實密封,環境溫度低于20℃建議適當保溫或延長發酵時間;制作液體菌劑和密封發酵飼料過程中會產生氣體注意放氣安全;密封好不開封的情況下發酵料可以保存1年以上不變質。密封效果不好會導致發酵料表面霉變,飼喂時要鏟除表面霉變的發酵料。
2、發酵料如果酸度過大,動物適口性差時可以在飼喂前混料時添加1%-2%小蘇打中和酸度,改善動物適口性,或者降低發酵飼料的使用量。
3、發酵料開封進行飼喂后,建議7天內使用完,每次取料后要注意繼續進行密封保存。
4、發酵料由于營養不全面,建議在飼喂混料時添加適當的能量飼料和蛋白飼料、預混料來調節營養配比,使動物達到更佳的飼喂效果和生長速度。
5、動物第一次飼喂發酵料必須遵循先少量飼喂然后逐步加量的原則,一般幼小階段動物最大添加量10%-20%,中等階段動物20%-30%,鄰近出欄階段30%-40%。在實際飼養中行適當的調整。
6、第一次使用發酵飼料可能會出現零星或者短時間的腹瀉,這些都屬于正常的現象。可以通過減少發酵料和添加藥物進行調整。連續使用發酵料一周后會發現動物的消化率大大的提高,糞便變松軟而且量變少,欄舍的氨臭味大大的減低。
7、飼喂本產品及發酵飼料不影響正常的動物免疫,動物發生疾病使用大劑量抗生素藥物時,繼續使用本品和發酵飼料無副作用,母畜與孕畜也可以使用。
【包裝規格】500克/包,30包/箱。規模養殖場可以提供25公斤裝或者進行產品定制。
【質保與儲存】12個月,常溫下于通風、陰涼、干燥處存放。
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