（3） 飼養(yǎng)管理

代謝試驗(yàn)在重慶市畜牧科學(xué)院雙河實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，所有試驗(yàn)豬采用代謝籠單獨(dú)飼養(yǎng)，預(yù)試期3 d，正試期4 d。粉料飼喂，每天飼喂3次（09：00、13：00、17：00），自由飲水，并觀察動(dòng)物的采食和健康狀況。每頭豬試驗(yàn)期的日采食量為預(yù)試期的平均日采食量。

（4） 樣品采集與處理

① 飼料樣品采集   于發(fā)酵第1天（即發(fā)酵菜籽粕混合物制作完成時(shí)）和發(fā)酵第5天分別取發(fā)酵菜籽粕混合樣，用于測定發(fā)酵前后pH、營養(yǎng)和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量；采集代謝試驗(yàn)用RSM、FRSM及4組試驗(yàn)飼料樣各30 0g左右，于4℃保存待 測營養(yǎng)成分。

② 糞、尿樣采集   正式試驗(yàn)期間，采用全收糞尿法，隨排隨收，每天08:00計(jì)算前1天的糞樣和尿樣。糞樣按照重量的5％加入10％硫酸，尿樣按照體積的2％加入10％硫酸，將混勻的糞樣和尿樣置于-20℃冰箱保存。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將每頭豬4 d的尿樣混勻，置于-20℃冰箱保存，待測。每頭豬的4 d糞樣混合均勻后，按Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組取樣50％，Ⅳ組全取，于65℃烘干，制備風(fēng)干樣，待測。

（5） 測定指標(biāo)及計(jì)算方法

①測定指標(biāo)及方法　 干物質(zhì)（dry matter, DM）：參照GB/T 6435-2014采用DHG-9246A鼓風(fēng)干燥箱測定；

粗蛋白質(zhì)（crude protein ,CP）：參照GB/T6432-1994采用FOSS2300自動(dòng)凱氏定氮儀測定；

水溶性蛋白質(zhì)（water soluble protein , WSP）：稱取2 g（精確至0.001 g）樣品置于150 mL三角瓶中，用移液管加入25 mL的pH為6.75±0.05的四硼酸鈉－磷酸二氫鈉緩沖液（緩沖液于39℃水浴鍋中預(yù)熱），在39℃下震蕩水浴1 h，用快速濾紙過濾，用移液管取5 mL濾液置凱式管中，然后參照GB/T6432-1994采用FOSS2300自動(dòng)凱氏定氮儀測定；

酸溶性蛋白質(zhì)（acid soluble protein, ASP）：準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確至0.001ｇ），加入體積分?jǐn)?shù)為15％的三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50 mL，靜置5 min后過濾；吸取10.00-25.00 mL濾液，然后參照GB/T 6432-1994采用FOSS2300自動(dòng)凱氏定氮儀測定；

異硫氰酸酯 （isothiocyanate, ITC）和噁唑烷硫酮（Oxazolidinone, OZT）參考文獻(xiàn)［15］中的紫外法進(jìn)行檢測；

粗灰分（crude ash, Ash）：參照GB/T 6438-2007測定；

鈣（calcium, Ca）：參照GB/T 6436-2002測定；

磷（phosphorus,P）：參照GB/T 6437-2002采用TU-1901紫外分光光度計(jì)測定；

能量（energy）：參照GB/T 213-2008采用6400氧彈量熱儀測定；

氨基酸（amino acid ,AA）：參照GB/T 18246-2000采用L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

② 待測營養(yǎng)物質(zhì)消化率計(jì)算公式　  飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率參照全收糞法計(jì)算，公式：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率（％）＝［（食入營養(yǎng)物質(zhì)-糞中營養(yǎng)物質(zhì)）/食入營養(yǎng)物質(zhì)］×100；

無氮飼糧用于估測內(nèi)源氮和內(nèi)源氨基酸損失，計(jì)算公式：

氮真消化率（％）＝｛［食入氮-（糞氮-內(nèi)源糞氮）］/食入氮｝×100；

氮表觀利用率（％）＝［（食入氮-糞氮-尿氮）/食入氮］×100；

氮真利用率（％）＝｛［食入氮-（糞氮-內(nèi)源糞氮）-（尿氮-內(nèi)源尿氮）］/食入氮｝×100；

氨基酸真消化率（％）＝｛［食入氨基酸-（糞中氨基酸-內(nèi)源氨基酸）］/食入氨基酸｝×100；

菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕營養(yǎng)物質(zhì)消化率通過下面公式計(jì)算：

D＝［100×（A-B）/F］＋B；F＝C1×f/［C1×f＋CO×（1-f）］

式中：D為待測飼料中某營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（％）；A為試驗(yàn)飼糧中某營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（％）；B為基礎(chǔ)飼糧中某營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（％）；F為試驗(yàn)飼糧營養(yǎng)物質(zhì)中待測原料營養(yǎng)物質(zhì)所占的比例（％）；f為試驗(yàn)飼糧中摻入待測原料的比例；CO為基礎(chǔ)飼糧中某營養(yǎng)物質(zhì)的含量；C1為待測原料中某營養(yǎng)物質(zhì)的含量。

（6） 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法進(jìn)行差異顯著性比較。分析結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)　果

（1） 發(fā)酵菜籽粕混合物發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)和主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量比較

麥麩通常用作固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，一方面為微生物提供碳氮源，另一方面使培養(yǎng)基質(zhì)地疏松，同時(shí)可以吸附住培養(yǎng)基中水分，有利于微生物的生長。本研究按照實(shí)驗(yàn)室所篩選 的發(fā)酵菌種和發(fā)酵工藝，將RSM與麥麩按7:3的比例混合制作發(fā)酵菜籽粕混合物，并比較其發(fā)酵前后營養(yǎng)和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量。由表2可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵菜籽粕混合物pH由5.60降至3.92，營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白質(zhì)、水溶性蛋白質(zhì)、酸溶性蛋白質(zhì)和粗脂肪的含量分別提高了1.91％、52.88％、44.40％和24.27％，17種氨基酸含量均有所提高。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別降低了5.21％ 和0.38％；異硫氰酸酯的降解率達(dá)到92.20％，噁唑烷硫酮的降解率達(dá)到100.00％；單寧和植酸分別降低了35.81％和24.22％。

（2）菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕的養(yǎng)分消化率

由表3可知，F(xiàn)RSM干物質(zhì)的表觀消化率較RSM提高10.32％（P＜0.05）；FRSM的消化能較RSM高2.16 MJ·kg-1（P＜0.01）；FRSM的氮表觀（真）消化率和氮表觀（真）利用率極顯著高于RSM（P＜0.01），分別高17.02％（16.40%）和29.43％（27.64％）；FRSM與RSM鈣、磷和粗灰分的表觀消化率差異不顯著（P＞0.05）。

（3）菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率

由表4可知，發(fā)酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率均高于菜籽粕，其中兩者半胱氨酸的表觀消化率（真）差異不顯著（P＞0.05），F(xiàn)RSM組氨酸和精氨酸的表觀（真）消化率顯著（P＜0.05）高于RSM，其他氨基酸的表觀（真）消化率均極顯著（P＜0.01）高于RSM；FRSM必需氨基酸中Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe、Lys、His、Arg的表觀（真）消化率分別比RSM高17.72％（16.79％）、26.05％（24.27％）、27.23％（21.71％）、14.68％（17.80％）、63.59％ （58.13％）、14.15％ （13.26％）、73.29％（65.66％）、4.61％ （4.47％）、4.87％ （4.33％）；FRSM的非必需氨基酸Pro、Cys、Ser、Tyr、Glu、Gly、Ala、Asp的表觀（真）消化率分別比RSM高11.08％（11.21％）、2.97％（1.97％）、14.02％（11.88％）、16.48％（15.12％）、10.76％（8.19％）、16.60％（16.12％）、37.69％（31.25％）、33.90％（25.80％）。

3 討　論

（1）發(fā)酵菜籽粕混合物發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)和主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

菜籽粕中存在大量抗?fàn)I養(yǎng)因子是限制菜籽粕在畜禽日糧中大量應(yīng)用的主要因素。研究表明，通過發(fā)酵處理菜籽粕可降低其抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，改變菜籽蛋白結(jié)構(gòu)，并能增加菜籽粕中多肽、有機(jī)酸等益生物質(zhì)的含量，有效改善菜籽粕的營養(yǎng)價(jià)值。本研究中，發(fā)酵菜籽粕混合物通過發(fā)酵，其pH降至4.0以下，酸度增加，營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白、水溶性蛋白質(zhì)、酸溶性蛋白質(zhì)、粗脂肪以及17種氨基酸含量均得到不同程度地提高，與上述研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，采用篩選的短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕，異硫氰酸酯和嗯唑烷硫酮降解率高達(dá)92.20％和100.00％，具有較強(qiáng)的降解作用，這與胡永娜等研究結(jié)果一致。胡永娜等采用枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和糞腸球菌混合發(fā)酵菜籽粕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的降解率分別高達(dá)96.20％和83.13％。付敏等采用枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白曲霉復(fù)合發(fā)酵菜籽粕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫苷降解率高達(dá)93.53％，噁唑烷硫酮全部被降解。孫林等選用6％植物乳桿菌、6％蠟樣芽胞桿菌、2％酪酸羧狀芽孢桿菌和6％枯草芽孢桿菌，34℃發(fā)酵2ｄ時(shí)，菜籽粕中植 酸的降解率高達(dá)90.15％，單寧降解率達(dá)98.17％。在本試驗(yàn)中，短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌對菜籽粕單寧和植酸的降解能力較低，分別為35.81％ 和24.22％。這可能與發(fā)酵所用菌種、發(fā)酵基質(zhì)中含水量、pH、溫濕度等多種因素有關(guān)。

（2）菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕的常規(guī)養(yǎng)分消化率

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)RSM較RSM極顯著提高了氮表觀（真）消化率和氮表觀（真）利用率，與Vig和Walia研究 證明，微生物發(fā)酵可以提高RSM蛋白質(zhì)消化率的結(jié)果一致。這是因?yàn)槲⑸锢闷潺嬰s的微生物區(qū)系和復(fù)雜的微生物酶系，對RSM的抗?fàn)I養(yǎng)成分及酶解底物進(jìn)行發(fā)酵分解，有效降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，同時(shí)微生物在發(fā)酵過程中其數(shù)量經(jīng)適應(yīng)期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期后大幅度增加，分泌大量的胞外酶分解發(fā)酵基質(zhì)，在蛋白酶作用下將大分子球蛋白質(zhì)降解為易于消化吸收的小分子蛋白（如水溶性蛋白質(zhì)和酸溶性蛋白質(zhì)）、小肽、寡肽等物質(zhì)，提高氮的利用率。此外，微生物在發(fā)酵過程中，還可以利用其降解產(chǎn)物或外界物質(zhì)（如培養(yǎng)基中的碳源和氮源）將非蛋白氮合成菌體蛋白，提高蛋白質(zhì)的含量，引起蛋白質(zhì)消化率升高。本研究結(jié)果表明FRSM干物質(zhì)的表觀消化率顯著高于RSM，這與付敏等、Shi等和Xu等通過固態(tài)混菌發(fā)酵菜籽粕（餅）的結(jié)果一致。這可能是通過微生物發(fā)酵降低了可溶性非淀粉多糖在消化道食糜的粘度，增加內(nèi)源酶的擴(kuò)散，提高了酶與養(yǎng)分的接觸面積，同時(shí)微生物分泌的纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶通過協(xié)同作用，破壞植物性飼料的細(xì)胞壁，使被細(xì)胞壁包裹的大分子營養(yǎng)物質(zhì)充分釋放出來被消化利用，從而促進(jìn)了干物質(zhì)的利用，提高干物質(zhì)的消化率。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)RSM的消化能極顯著高于RSM，可能是因?yàn)镽SM在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的活性肽類物質(zhì)可以提高豬的采食量，從而提高消化能。另外，纖維素占RSM中總多糖含量的24.1％，固態(tài)發(fā)酵過程中部分中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維被降解，使其沒有完全在豬腸道中發(fā)酵，導(dǎo)致FRSM中可發(fā)酵糖的濃度增加，從而提高了FRSM的消化能。

（3）菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)RSM氨基酸（除半胱氨酸）消化率均顯著或極顯著高于RSM。這是因?yàn)镽SM中含有GS、單寧、植酸和纖維等抗?fàn)I養(yǎng)因子。首先，GS在芥子酶作用下會(huì)產(chǎn)生OZT、ITC等有毒物質(zhì)，降低飼料適口性，引起甲狀腺腫大，降低營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。其次，研究表明單寧含量與必需氨基酸和非必需氨基酸的消化率之間存在顯著的反比關(guān)系。Jansman等給大鼠飼喂富含單寧  的蠶豆克，結(jié)果表明隨著單寧含量的不斷增加，大鼠糞便中必需氨基酸（r2＝0.97）和非必需氨基酸（r2＝0.27～0.99）的表觀消化率呈線性下降，且必需氨基酸的消化率受到的影響程度低于非必需氨基酸，特別是脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸。據(jù)推測，氨基酸消化率顯著降低可能與膳食單寧與腮腺分泌的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)和內(nèi)源蛋白質(zhì)的相互作用，降低胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶和腸道刷狀緣肽酶的活性有關(guān)。再者，植酸與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的二元復(fù)合物會(huì)抑制胃腸道蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，降低蛋白質(zhì)的消化率。Antony和Chandra通過發(fā)酵處理小米粟，其植酸含量降低23％～26％，胃蛋白酶和胰 酶對小米粟蛋白的體外消化率提高了14％～26％。另外，通過補(bǔ)充微生物植酸酶釋放肌醇六磷酸結(jié)合蛋白，也可以提高蛋白質(zhì)/氨基酸的消化率和利用率，尤其對蘇氨酸消化率的改善最大，這與本試驗(yàn)蘇氨酸消化率提高幅度最大的結(jié)果一致。除此之外，纖維含量過高也會(huì)降低蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率，水溶性纖維的膠凝和粘度特性減少腸內(nèi)容物的混合，阻斷酶-底物的相互作用，形成營養(yǎng)吸收的生理屏障，從而降低了營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。本研究通過短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌固態(tài)發(fā)酵RSM，其纖維、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量和物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著降低，降低了不溶性纖維和抗?fàn)I養(yǎng)因子對氨基酸消化率的不良作用，同時(shí)通過微生物發(fā)酵增加了酸溶性蛋白質(zhì)、水溶性蛋白質(zhì)和游離氨 基酸的含量，從而顯著提高了FRSM氨基酸的表觀（真）消化率。

4 結(jié)　論

本研究通過雙菌固態(tài)發(fā)酵降低了菜籽粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，改善了菜籽粕的飼用品質(zhì)，提高了菜籽粕在育肥豬上的養(yǎng)分消化率和利用率。

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