發酵飼料用具有潛在益生功能芽孢桿菌的篩選及性質研究

2020-04-02 17:08:59 點擊：

摘要：試驗旨在篩選1株發酵飼料用拮抗大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌的益生芽孢桿菌菌株。通過十字劃線法和平板擴散法進行拮抗大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌菌株的篩選，將篩選出的具有較強抑菌活性的菌株進行菌種鑒定，研究其在不同pH值、溫度、膽鹽濃度下的生長勢，以及代謝產物的酶活力。結果表明：篩選得到3株可同時拮抗大腸桿菌、沙門氏菌以及痢疾桿菌的芽孢桿菌菌株，分別為B-1d、B-2d、A14，經過形態學觀察和16SrDNA序列分析初步確定B-1d為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），B-2d、A14為莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus Mojave）。3株菌均可以在27~47℃正常繁殖，在pH值4.5~6.5之間能正常生長，在0.6g/L的膽鹽下仍可以生長，還代謝產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶。試驗得到了3株具有潛在益生功能的發酵飼料用芽孢桿菌菌株。

目前，在農業農村部正式啟動了“飼料安全工程”，并發布194號文公布后，“無抗”、“禁抗”成為熱點話題。尋找一種安全高效的手段來替代抗生素已成為飼料生產行業的重中之重。而益生菌可以通過自身的生長代謝，將飼料中的一些生物大分子分解，產生更有利于動物采食和利用的富含高活性益生菌及其代謝產物的飼料，因而日益受到人們的關注。1989年，Fuller將益生菌定義為可以維持動物機體腸道中微生物菌群的動態平衡，并對宿主產生有益影響的活的微生物。最常被用作益生菌的微生物是乳酸菌和酵母菌。芽孢桿菌廣泛分布在各種環境中，具有較強的耐受性，并且具有較強的穩定性，該菌也被認為是比較好的抗生素替代品，將其用于發酵飼料中能夠刺激動物免疫器官的生長發育，并能迅速大量繁殖。2003年，枯草芽孢桿菌被農業農村部納入可作為微生物飼料添加劑的菌種，已成為一種理想的微生態制劑菌種。本研究擬從多種樣品中篩選能夠高效拮抗多種腸道病原菌的芽孢桿菌，并對其進行種屬鑒定、不同溫度、pH值、膽酸鹽濃度下的生長情況、產酶特性等研究，為新型“替抗”益生菌的篩選提供更多的微生物種質資源。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

實驗室保藏芽孢桿菌菌株，篩選自養殖場土壤、畜禽糞便等樣品。

1.1.2 試驗菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、痢疾桿菌（Shigella Castellani）由河北農業大學制藥工程實驗室提供。

1.1.3 培養基

NA培養基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂1.5%~2.0%，pH值7.2~7.4。NB培養基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，pH值7.2~7.4。發酵培養基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉8.5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、葡萄糖1g/L。LB培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值7.2。

1.2 菌株初篩

活化大腸桿菌菌種，并制備發酵液。將大腸桿菌培養液按1%的比例加到NA培養基中，充分混勻倒板，制成大腸桿菌病原菌平板。將實驗室4℃冰箱保藏的單菌落菌株，采用十字劃線法接種到大腸桿菌平板上，37℃培養觀察其對大腸桿菌的拮抗情況。

1.3 菌株復篩

在初篩獲得的菌株中，為了排除是生長競爭所導致大腸桿菌沒有生長，采取平板擴散法進行復篩，觀察抑菌圈直徑。參照1.2和1.3的方法，將復篩得到的菌株依次用于沙門氏菌和痢疾桿菌拮抗菌的篩選，綜合對3株病原菌的抑菌能力優選出3株拮抗菌進行后續研究。

1.4 功能菌株的種屬鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行形態學觀察。通過16SrDNA序列分析進行分子學鑒定，通過測序結果進行同源性比較，建立系統發育樹，初步確定種屬地位。

1.5 功能菌株的性質研究

1.5.1 功能菌株在不同pH值下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于pH值為3.5、4.5、5.5、6.5的100mL發酵培養基中。37℃、180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.5.2 功能菌株在不同溫度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于100mL發酵培養基中，分別在27、37、47℃，180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.5.3 功能菌株在不同膽鹽濃度下的生長情況

制備功能菌株種子液，以1%的接種量轉接于膽鹽濃度分別為0、0.15、0.30、0.60g/L的100mL發酵培養基中，37℃、180r/min培養48h，測定發酵液在600nm下的吸光值。

1.6 功能菌株產消化酶情況

1.6.1 菌株產蛋白酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了10%脫脂奶粉的LB平板中，37℃培養觀察是否有水解圈。

1.6.2 菌株產淀粉酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了1%淀粉的LB平板中，37℃培養48h，加入碘液觀察是否有水解圈。

1.6.3 菌株產纖維素酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入剛果紅平板中，37℃培養48h觀察是否有水解圈。

1.6.4 菌株產脂肪酶情況

通過平板擴散法將菌株發酵液離心上清液加入添加了1%三丁酸甘油酯的平板中。37℃培養72h觀察是否出現水解圈。

2結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

2.1.1 拮抗大腸桿菌菌株的篩選

初篩共獲得120株對大腸桿菌具有抑菌活性的芽孢桿菌。選擇抑菌圈較大的100株菌通過平板擴散法進行復篩，共得到了95株抑菌圈比較明顯的菌株，如圖1所示。

2.1.2 拮抗沙門氏菌的菌株篩選

初篩得到對沙門氏菌具有抑菌活性的芽孢桿菌60株，復篩得到抑菌圈比較明顯的菌株45株，如圖2所示。

2.1.3 拮抗痢疾桿菌的篩選

初篩得到對痢疾桿菌具有抑菌活性的芽孢桿菌20株，復篩得到抑菌圈比較明顯的菌株18株，如圖3所示。

2.2 菌株的種屬鑒定

2.2.1 菌株的形態鑒定

挑選對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌均有較大抑菌圈的菌株B-1d、B-2d、A14進行形態觀察，結果見表1。

2.2.2 菌株的分子生物學鑒定

將B-1d、B-2d、A14的16S rDNA序列與GenBank中已有原核生物的16S rDNA序列進行比對，用PHYLIP programpackage處理數據制作系統發育樹（如圖4所示），發現B-1d與枯草芽孢桿菌聚到了一起，A14、B-2d與莫哈韋芽孢桿菌聚到了一起，初步確定B-1d為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），A14、B-2d為莫哈韋芽孢桿菌（Mojave Bacillus）。

2. 3菌株的性質研究

2.3.1 菌株在不同溫度下的生長情況（見圖5）

由圖5可知，菌株B-1d、B-2d、A14在溫度為27~47℃范圍內均能正常生長，表明在多種溫度條件下均能發酵飼料。

2.3.2 菌株在不同pH值下的生長情況（見圖6）

由圖6可知，3株菌在pH值4.5~6.5范圍內均可以正常生長，表明能夠適應發酵過程中較酸的pH環境。

2.3.3菌株對膽鹽的耐受性（見圖7）

功能菌株在發酵飼料的過程中會大量的增殖，并且可以隨著發酵料進入動物的腸道進而發揮益生的功能，這就需要耐受一定濃度的膽鹽。由圖7可知，3株菌在0.6g/L的膽鹽濃度下仍可以生長，說明能夠耐受較強濃度的膽鹽。

2.4 菌株產消化酶情況

對芽孢桿菌的產酶特性定性檢測可以發現，菌株B-1d、B-2d、A14在各產酶平板上均出現水解透明圈（見圖8），說明3株菌都可以產蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶，這樣在發酵飼料的過程中可以在物料中積累大量的消化酶，從而可以提高畜禽的生長性能。

3討論

AGP作為一種非營養型的飼料添加劑，在促進動物生長，提高動物生產性能方面起著積極的作用，但是長期使用抗生素，會使病菌的抗藥性增強，從而造成不同程度的感染。近年來，細菌耐藥性等問題日益突出，無毒、無公害的微生態飼料添加劑的研究和開發顯得日益重要。隨著人們對更安全、優質的畜禽產品的追求，無抗養殖成為大勢所趨，發酵飼料將起著非常重要的作用。目前，用于發酵飼料的添加劑有酸化劑、益生菌、酶制劑等物質，其中益生菌具有促進動物腸道有益菌群的形成等優勢，受到廣泛好評。近幾年，研究發現益生菌也可以直接添加到飼料中，操作簡便、成本較低廉、不會破壞飼料中的營養成分，還能提高飼料報酬，確保畜牧業安全生產，同時提高了經濟效益。芽孢桿菌所進行的生物轉化法能夠產生抑制大腸桿菌生長的益生作用，抑制有害病原菌的生長和增強抵抗疾病的能力，可以廣泛應用于畜牧行業中。

本研究得到的3株益生芽孢桿菌可以拮抗3種腸道病原菌的生長，并且可以耐受胃酸和膽鹽的環境，這樣就可以保證菌株隨著發酵飼料進入腸道后有定植的可能，進一步發揮抗病的功能。近年來，一些真菌、細菌的代謝產物被證實能夠起到益生作用，但大部分不可以直接加入飼料中對牲畜直接投喂，其提取產物的過程較為復雜、成本高。動物飼料中添加各種酶有利于動物生產，因為酶可以幫助消化飼料，提升飼料報酬，故酶制劑在動物生產中應用廣泛。利用飼用益生菌本身產酶特性制備微生態制劑，在動物消化也可起到重要作用。本研究得到的3株芽孢桿菌均可以產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶，具備益生菌的潛質。芽孢桿菌可以形成芽孢體，抗逆性強，有利于產品的生產工藝和貯藏，進而保證產品的質量。本研究得到的菌株可以在不同的溫度生長，并且可以耐受較低的pH值環境，這樣就能解決菌株的干燥不耐高溫和倉儲期短的問題。因此，本研究篩選到的芽孢桿菌可以很好地應用于發酵飼料中，能達到減抗、替抗的效果，尤其是菌株B-1d為枯草芽孢桿菌，在飼料添加劑的目錄中，可直接用于畜禽行業。

4結論

本試驗篩選得到3株可以同時拮抗大腸桿菌、痢疾桿菌以及沙門氏菌的芽孢桿菌，菌株特性優良，具有益生菌的潛在特性。

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