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豆粕在畜禽飼料中應用十分廣泛，但豆粕含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白及寡糖等抗營養因子，限制了其在幼齡動物中的使用。微生物發酵可以將豆粕中大分子抗原蛋白降解為容易被幼齡動物消化吸收的小分子蛋白，將不能消化吸收的植酸磷降解為無機磷，同時產生益生素、乳酸及未知生長因子等，從而提高豆粕的營養價值。酶解也是改善豆粕蛋白質特性的一種很好的方法，大豆蛋白酶解物具有比大豆蛋白更豐富的加工特性、營養特性和生理功能。單純發酵耗時長、損耗大、效率低，單純酶解工藝雖然耗時短、損耗小、效率高，但是雜菌增殖難以控制，在酶解過程中加入益生菌發酵可以有效地抑制大腸桿菌等雜菌的增殖。豆粕經酶解發酵后可產生大量活性益生菌、乳酸、小肽和游離氨基酸等，添加到幼齡動物全價配合飼料中可以替代促生長性抗生素。本試驗將木瓜蛋白酶和植物乳桿菌共同作用于豆粕進行酶解和發酵，旨在研究豆粕酶解發酵物對仔豬的生長性能、血清指標及腸道菌群結構的影響，為家畜無抗飼料健康養殖提供有益參考。

1.1 酶解發酵豆粕的制備

參考魏金濤等的方法，在塑料桶中加入10ｋｇ粒徑12目的豆粕，按300U/ｇ 添加木瓜蛋白酶、2×10⁷ CFU/ｇ 接種植物乳桿菌之后加入37℃溫水30ｋｇ，攪拌均勻后置于37 ℃ 恒溫培養箱中酶解發酵24ｈ，所得豆粕酶解發酵物用于配制飼糧。飼喂用的豆粕酶解發酵物均在配料前1天的07：00和15：00各制備1次。

1.2 試驗動物與飼養管理

1.2.1 試驗動物與試驗設計

采用單因子完全隨機試驗設計，按照品種、胎次基本一致的原則，將144 頭9日齡健康的“杜×長×大”三元雜交育肥仔豬隨機分為３ 組，每組６個重復，每個重復８ 頭豬（公母各占1/2）。陰性對照組飼喂基礎飼糧，抗生素對照組飼喂基礎飼糧＋60ｇ/ｔ 吉他霉素，試驗組飼喂試驗飼糧（基礎飼糧中10％豆粕被豆粕酶解發酵物替代）。預試期7ｄ，正試期42ｄ。

1.2.2 飼養管理

試驗場地采用漏縫地板，豬只自由采食，自由飲水。免疫消毒程序按照豬場常規方法進行。

1.3 試驗飼糧

飼糧參照NRC（2012） 豬的營養需要并結合所在豬場生產實際制定配方，其組成及營養水平見表1。陰性對照組飼糧飼喂前添加自來水做成濕拌料，精確計算水的添加量，保證飼糧中含水量為28％左右。

1.4 樣品的采集與制備

1.4.1 血液采集與血清的制備

在正試期第42天從每組選取6頭豬，抽取頸靜脈血靜置后3000r/min 離心10min，制備的血清置于-70℃ 超低溫冰箱中保存備用。

1.4.2 盲腸內容物的采集

在正試期第42天從每組選取6頭豬，頸部放血致死，無菌條件下取十二指腸、盲腸和大腸內容物于滅菌的凍存管中，并迅速將凍存管放于充滿液氮的液氮罐中，備測。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 試驗儀器

AUY-220型電子分析天平，日本島津UV-2550型紫外可見分光光度計，德國福斯FOSS-2300型全自動凱氏定氮儀，羅氏MODULP-800全自動生化分析儀，EDC-810PCR擴增儀，JY300水平電泳儀，JY-02S 紫外分析儀。

1.5.2 營養成分的測定

粗蛋白質含量測定按照GB/T6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》進行；小肽含量測定按照GB/T22492-2008《大豆肽粉》方法進行；水溶性蛋白含量測定按照NY/T1205-2006《大豆水溶性蛋白含量的測定》方法進行；乳酸桿菌數量的測定采用MRS 瓊脂培養基計數。

1.5.3 生長性能的測定

分別在試驗開始與試驗結束時，以個體為單位對所有試驗豬進行空腹稱重；試驗過程中詳細觀察與記錄仔豬健康和生長狀況、采食量、腹瀉等情況。計算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率等。

1.5.4 血清指標的測定

血清生化指標的測定采用羅氏MODULP-800全自動生化分析儀測定。

血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量等測定采用試劑盒法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 腸道菌群結構的測定

采用實時熒光定量PCR方法測定腸道中總細菌數、乳酸桿菌數和大腸桿菌數。引物序列及參數見表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照北京天根基因組DNA提取試劑盒說明書提取腸內容物DNA，通過將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠進行回收，純化分別獲得總細菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的標準品，然后將細菌的標準品進行實時熒光定量PCR反應，以不同標準品的拷貝數的對數值為橫坐標，以實時熒光定量PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數（Ct）為縱坐標繪制標準曲線。同時，將待測樣品進行實時熒光定量PCR反應得到樣品的Ct值，并將其和標準曲線進行比較，獲得各個樣品中細菌數量。

1.6 數據統計分析

采用SPSS 18.0 統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），不同組間的平均值差異用Student-Newman-Keuls（S-N-K） 比較 。數據結果采用“平均值±標準差”表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2.1 豆粕酶解發酵前后營養成分變化

從表３ 可知，豆粕酶解發酵前后總能及粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷含量差異不顯著（P＞0.05）；但是豆粕酶解發酵物中的小肽和水溶性蛋白含量比豆粕分別提高了3.56倍和4.76倍（P＜0.05），乳酸桿菌數量達到6.14×10⁹CFU/ｇ。

2.2 豆粕酶解發酵物對仔豬生長性能的影響

從表4可知，試驗組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量分別比陰性對照組提高5.06％、10.07％、5.03％（P＜0.05），腹瀉率比陰性對照組降低39.59％（P＜0.05）；試驗組與抗生素對照組相比各指標差異均不顯著（P ＞0.05），但是平均日增重和平均日采食量都有高于抗生素對照組的趨勢。

2.3 豆粕酶解發酵物對仔豬血清指標的影響

從表５ 可知，試驗組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶活性均顯著高于陰性對照組（P ＜0.05），其他指標差異不顯著（P ＞0.05）；試驗組和抗生素對照組仔豬血清生化指標差異不顯著（P＞0.05）。

從表6可知，試驗組仔豬血清T-AOC、SOD 活性、MDA 含量與陰性對照組相比均有顯著改善（P＜0.05），與抗生素對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 豆粕酶解發酵物對仔豬腸道菌群結構的影響

從表７ 可知，試驗組仔豬盲腸、大腸中乳酸桿菌數量顯著高于陰性對照組和抗生素對照組（P＜0.05）；豆粕酶解發酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數量增加幅度越大；試驗組仔豬腸道中盲腸、大腸中的大腸桿菌數量有低于抗生素對照組和陰性對照組的趨勢（P＞0.05）。試驗組十二指腸中總細菌數比陰性對照組和抗生素對照組低（P ＜0.05），各組間盲腸、大腸中總細菌數差異不顯著（P＞0.05）。

3.1 豆粕酶解發酵物對仔豬生長性能的影響

潘翠玲等發現大豆蛋白酶解物能克服早期斷乳應激引起的仔豬食欲下降、腹瀉和生長遲滯等不良現象。付曉等報道酶解豆粕組仔豬粗蛋白質、鈣和磷消化率均高于對照組。這都說明了豆粕酶解后更容易被仔豬消化吸收。詹湉湉等報道豆粕合理的發酵時間為72ｈ，料水比為1∶0.7，寡肽和游離氨基酸含量可達2.48％。胡瑞等將豆粕液態發酵最佳發酵時間為48ｈ，但是加入蛋白酶后發酵豆粕游離氨基酸含量提高了0.36％，大分子蛋白質降解程度顯著升高。本研究利用木瓜蛋白酶和植物乳桿菌在液態酶解發酵豆粕24ｈ后小肽含量達到了9.63％，飼養試驗結果表明試驗組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量略優于抗生素對照組， 和陰性對照組相比提高了5.06％、10.07％、5.03％。這主要是由于豆粕酶解發酵后大分子蛋白被分解，提高了部分氨基酸含量，部分抗營養因子被降解，而且豆粕在液態下經植物乳桿菌發酵后產生大量乳酸等，使得所配制飼料具有酸香味，刺激動物食欲。本文中試驗組仔豬腹瀉率比陰性對照組低39.59％，與抗生素對照組差異不顯著，據呂剛等報道酶解豆粕濕喂仔豬組全期料重比、腹瀉指數優于干燥酶解豆粕組。本試驗結果說明了豆粕酶解發酵后不經干燥直接配制飼糧，提高了飼糧適口性，有益于動物生長性能的提高，可以實現仔豬飼料中不添加促生長性抗生素。但是中國南方高溫季節采用濕的豆粕酶解發酵物一定要防止原料久置變質。

3.2 豆粕酶解發酵物對仔豬血清指標的影響

血清堿性磷酸酶活性高低可以反映動物的生長速度和生長性能。本試驗中試驗組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶活性均顯著高于陰性對照組，說明豆粕酶解發酵物可以促進仔豬蛋白質吸收，提高鈣磷利用率，這與生長性能的表現呈一致性。機體內存在的各種抗氧化酶能夠互相合作共同構成機體對自由基的第一道防線。血清MDA含量的高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本試驗中試驗組仔豬血清T-AOC、SOD活性顯著高于陰性對照組，MDA含量顯著低于陰性對照組，說明豆粕酶解發酵物提高了仔豬機體抗氧化能力，減少自由基對機體的傷害。

3.3 豆粕酶解發酵物對仔豬腸道菌群結構的影響

健康仔豬腸道中多種細菌數量都隨腸段后移而逐漸增加。乳酸桿菌是豬腸道正常菌群中的重要優勢菌。若仔豬發生腹瀉，仔豬腸道內優勢菌群數量會發生改變，如乳酸桿菌、雙歧桿菌數量會降低，大腸桿菌的數量增加。本研究中試驗組仔豬盲腸、大腸段乳酸桿菌數量顯著高于陰性對照組和抗生素對照組；豆粕酶解發酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數量增加幅度越大。試驗組十二指腸中總細菌數比陰性對照組和抗生素對照組低，且十二指腸段總細菌數低于盲腸、大腸。這主要是由于十二指腸細菌的種類及數量極少，胃酸、膽汁作用及小腸液流量大，蠕動節奏快，細菌在繁殖前即被沖洗到遠端回腸及結腸。試驗組仔豬腸道中乳酸桿菌為優勢菌群，擠占了大腸桿菌的生存空間，使得大腸桿菌數量下降，試驗豬只腹瀉率降低。本試驗中抗生素選用的為目前在家禽和豬飼料中廣泛使用的吉他霉素，吉他霉素可以使豬腸道中大腸桿菌數量顯著減少，對乳酸桿菌數量卻沒有顯著影響。仔豬腸道菌群由乳酸桿菌、雙歧桿菌、小梭菌等厭氧菌以及腸桿菌、腸球菌等需氧菌組成，后期研究中筆者將對仔豬腸道中的雙歧桿菌、腸球菌等進行分析定量，更為全面地了解豆粕酶解發酵物對仔豬腸道中菌群結構的影響。

豆粕酶解發酵物能促進仔豬生長發育，提高生長性能，增強機體抗氧化能力，利于乳酸桿菌在腸道內形成優勢菌群。