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在奶牛生產(chǎn)中,較低的飼糧利用率一直是限制奶牛生產(chǎn)性能提高的重要因素。外源復(fù)合酶制劑是一類從生物中提取、具有酶特性的物質(zhì),它以綠色、安全、高效等優(yōu)點迅速成為飼用添加劑領(lǐng)域的研究熱點。酶制劑最初應(yīng)用于單胃動物(如豬、雞等),有利于改善其飼糧利用率和生產(chǎn)性能,而在反芻動物上的應(yīng)用研究起步相對較晚,起初研究者認為酶制劑會受到瘤胃內(nèi)微生物的破壞而失活。近年來的研究發(fā)現(xiàn),外源酶能夠在瘤胃內(nèi)穩(wěn)定存在,這再次引起研究者在反芻動物上使用外源酶制劑的興趣。有研究結(jié)果表明,添加外源酶制劑有利于提高飼糧的消化率,增加奶牛產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)。但也有報道認為酶制劑對奶牛生產(chǎn)性能無顯著影響。酶制劑的應(yīng)用效果與酶制劑的種類、添加方式、劑量和生產(chǎn)方法等因素有關(guān)。單一酶制劑由于功能單一,所以效果不佳,現(xiàn)在多用復(fù)合酶制劑。目前復(fù)合酶制劑在奶牛上的研究較多的是降解植物細胞壁成分的纖維素酶和木聚糖酶,有關(guān)纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶和中性蛋白酶共同制成的復(fù)合酶制劑的應(yīng)用效果研究較少。本試驗采用的纖維素酶是經(jīng)過生物工程改造后的二代里氏木霉,再配合木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶和中性蛋白酶制成復(fù)合酶制劑,研究該復(fù)合酶制劑對奶牛瘤胃發(fā)酵、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)和生產(chǎn)性能的影響,同時探討其在泌乳奶牛飼糧中的適宜添加量,為其在生產(chǎn)中應(yīng)用及作用機理研究提供參考。

1.1 試驗材料

本試驗所用外源復(fù)合酶制劑由寧夏某公司提供,主要成分包括纖維素酶15 000 U/g、木聚糖酶100 000 U/g、β-葡聚糖酶280 000 U/g、甘露聚糖酶2 500 U/g、果膠酶60 000 U/g和中性蛋白酶2 000 U/g。

1.2 試驗動物及試驗設(shè)計

根據(jù)體重、胎次、泌乳天數(shù)和產(chǎn)奶量相同或相近的原則, 選擇32頭健康荷斯坦泌乳早期奶牛, 采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計分為4組, 每組8頭, 每頭即1個重復(fù), 對照組飼喂不添加復(fù)合酶制劑的基礎(chǔ)飼糧, 試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.10%、0.15%和0.20%復(fù)合酶制劑的試驗飼糧。先將復(fù)合酶制劑根據(jù)試驗設(shè)計的添加量與精料混合均勻, 再與粗飼料混合均勻制成全混合日糧飼喂奶牛。試驗預(yù)試期10 d, 正試期56 d。試驗牛基本情況見表1。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定

1.4.1 采食量和相關(guān)指標(biāo)測定

采用Insentec自動采食系統(tǒng)自動記錄每天采食量。試驗期每周采集2次飼糧, 測定飼糧中干物質(zhì) (DM) 含量, 根據(jù)每天記錄的采食量、產(chǎn)奶量, 計算干物質(zhì)采食量 (DMI) 和飼料轉(zhuǎn)化率 (FCR) 。參照國家標(biāo)準(zhǔn)的方法測定DM、粗蛋白質(zhì) (CP) 、中性洗滌纖維 (NDF) 、酸性洗滌纖維 (ADF) 和粗灰分 (Ash) 含量, 根據(jù)粗灰分含量計算有機物 (OM) 含量。

1.4.2 瘤胃液采集和相關(guān)指標(biāo)測定

正試期第54天, 于晨飼后1 h, 使用胃管式瘤胃液采樣器 (MDW-15, 上海硅狄公司) 從口腔采集瘤胃液100 mL, 經(jīng)4層紗布過濾后, 立即采用pH計 (SevenGo™ pH-SG2型, 上海綻興儀器科技有限公司) 測定pH, 然后分裝于10 mL離心管中, 置于-20℃保存, 用于測定瘤胃液中氨態(tài)氮 (NH₃-N) 、微生物蛋白 (M CP) 和揮發(fā)性脂肪酸 (VFA) 含量。NH₃-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法在酶標(biāo)儀 (Thermo Electron Varioskan Flas, 上海輔澤商貿(mào)有限公司) 上測定, MCP含量采用嘌呤堿基法在酶標(biāo)儀上測定, VFA含量采用氣相色譜儀 (Agilent-6890N型, 北京北分天普儀器技術(shù)有限公司) 測定。

1.4.3 血樣采集和相關(guān)指標(biāo)測定

正試期第54天, 于晨飼前1h, 使用真空采血管尾靜脈采血10 mL,將采集的血樣放入離心機 (Himac-CR22G型) 2 000×g離心10 min, 用吸管取上層血清于2 mL離心管中, 置于-20℃保存。血清樣品送至華英生物科技有限公司采用邁瑞B(yǎng)S300型生化分析儀 (北京邁潤醫(yī)療醫(yī)療器械有限公司) 測定尿素氮 (UN) 、葡萄糖 (GLU) 、肌酸酐 (CR) 、總蛋白 (TP) 、白蛋白 (ALB) 、總膽固醇(TC)和β-羥丁酸 (BHAH) 含量。

1.4.4 產(chǎn)奶量和乳成分測定

采用美國Bou Matic自動擠奶系統(tǒng)記錄產(chǎn)奶量,并計算3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量。正試期每周采集1次新鮮奶樣,早、中、晚按4∶3∶3比例采集50 mL, 加1粒重鉻酸鉀防腐,送北京市奶牛中心,采用多功能乳成分分析儀(Milko Scan 605,FossElectric,Hillerod,丹麥)測定乳糖率、乳脂率、乳蛋白率及體細胞數(shù)(SSC)。

1.4.5 糞樣采集和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測定

正試期第54~57天進行奶牛消化試驗。采用直腸采糞法,連續(xù)采集糞樣12次,采集時間點為第54天的08:00、14:00、20:00,第55天的02:00、10:00、16:00、22:00,第56天的04:00、12:00、18:00、24:00,第57天的06:00。采樣結(jié)束后,將每頭牛的各個時間點糞樣混合,縮成2份樣品,每份500g,一份立即用10%的鹽酸進行固氮,用于CP含量測定,另一份不固氮,用于其他營養(yǎng)物質(zhì)含量測定。消化試驗結(jié)束后將每頭牛3d的樣品混合,縮樣,之后置于65℃烘箱里烘至恒重,再放入空氣中回潮,粉碎后過40目篩,即得風(fēng)干樣品,用于營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測定。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率以酸不溶灰分(AIA)為內(nèi)標(biāo),采用內(nèi)源指示劑法測定DM、CP、NDF、ADF和OM的表觀消化率。

某營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=

100×［1－(A×D/B×C)］，

式中:A為飼糧中AIA含量(g/kg);B為飼糧中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(g/kg);C為糞中AIA含量(g/kg);D為糞中該營養(yǎng)物質(zhì)含量(g/kg)。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用SAS 9.2軟件包中的PROCMIXED程序進行方差分析。添加量對試驗結(jié)果的影響進行線性和二次相關(guān)關(guān)系顯著性檢驗,試驗結(jié)果以最小二乘均值表示。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶制劑對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

由表3可知,與對照組相比,飼糧中添加0.15%復(fù)合酶制劑能顯著提高總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05);添加復(fù)合酶制劑有降低pH(P=0.09)和提高乙酸含量(P=0.08)的趨勢。此外,與對照組相比,丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸、氨態(tài)氮和MCP含量均未受到復(fù)合酶制劑的影響(P>0.05),但MCP含量有線性增加趨勢(P=0.05)。

3.1 復(fù)合酶制劑對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

VFA是飼糧中碳水化合物在瘤胃發(fā)酵的主要產(chǎn)物, 不僅是機體所需碳架的主要來源, 也是機體維持生長、繁殖和泌乳的重要能量來源, 可為泌乳奶牛提供所需能量的70%~80%。因此, VFA含量變化可在一定程度上反映瘤胃發(fā)酵類型和反芻動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用情況。賈仙寶在飼糧中添加外源纖維素酶飼喂奶牛, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.1%纖維素酶顯著提高瘤胃VFA含量;李朝云報道, 在奶牛高粗飼糧和中粗飼糧中添加纖維素酶, 瘤胃VFA含量要高于高精飼糧和對照組;陳宇通過對湖羊瘤胃發(fā)酵的研究, 發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加20 mg/kg外源酶時效果最佳, 瘤胃VFA含量比對照組顯著增加了37%;Arriola等發(fā)現(xiàn), 添加纖維酶使奶牛瘤胃液中TVFA含量增加, 乙酸/丙酸下降。因此, 酶制劑對瘤胃VFA產(chǎn)量的作用效果與酶制劑的種類、添加量、飼糧精粗比和試驗動物種類等因素有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn), 飼糧中添加0.15%復(fù)合酶制劑能顯著影響TVFA含量, 且乙酸含量也有增加趨勢, 這與前人研究結(jié)果一致。

NH₃-N是瘤胃微生物合成MCP和機體蛋白質(zhì)的主要原料, 其含量可反映在特定飼糧下蛋白質(zhì)降解與合成間所形成的一個平衡狀態(tài)。NH₃-N和MCP含量也反映了瘤胃微生物對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用的程度。一般認為, 添加酶制劑通過增加瘤胃微生物的數(shù)量來促進瘤胃發(fā)酵。呼和等發(fā)現(xiàn), 外源酶制劑顯著提高奶牛瘤胃微生物菌群數(shù)量, 如黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和反芻獸真細菌等的數(shù)量;Yang等研究發(fā)現(xiàn), 在奶牛飼糧中添加纖維素酶和木聚糖酶, 不但提高了NDF的消化率, 而且MCP產(chǎn)量也相應(yīng)增加, 這與本試驗結(jié)果一致。

飼料轉(zhuǎn)化率=3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量/干物質(zhì)采食量。FCR=3.5%FCM yeild/DMI.

瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵的綜合指標(biāo), 適宜VFA形成的pH為6.2~6.6;適宜NH₃-N利用的pH為5.7~6.2。在本試驗中, 瘤胃液pH有下降趨勢, 這可能由于添加復(fù)合酶制劑促進TVFA的形成, 導(dǎo)致瘤胃液pH降低, 但各組pH均處于正常范圍內(nèi)。

3.2 復(fù)合酶制劑對奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

有研究表明, 復(fù)合酶制劑不僅可以增加瘤胃中纖維降解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等酶的活性, 還可增加小腸中纖維降解酶和木聚糖酶的活性。因此, 消化道內(nèi)酶活性的增加為飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的利用提供了保障。徐學(xué)文等報道, 飼糧中添加4種商業(yè)復(fù)合酶制劑飼喂奶牛均能促進DM和CP的消化, 并且在一定程度上有利于提高NDF和ADF的消化率;Knowlton等在奶牛飼糧中添加以纖維素酶和植酸酶為主的酶制劑, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶制劑能夠減少糞中DM、NDF、ADF、氮 (N) 和磷 (P) 的排放, 從而提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化率;Peters等研究發(fā)現(xiàn), 在飼糧中添加纖維素酶和木聚糖酶對DM、OM、NDF和ADF降解率均無影響。在本試驗中, 飼糧中添加復(fù)合酶制劑顯著提高DM和NDF表觀消化率, 且隨著添加劑量增加, DM、OM和NDF的表觀消化率呈線性增加, 這可能是由于復(fù)合酶制劑能夠依附于飼糧, 破壞植物飼料表面的纖維結(jié)構(gòu), 使飼糧釋放更多的還原糖, 從而提高瘤胃中木聚糖水解菌、纖維二糖利用菌等微生物的繁殖, 進而提高飼糧利用率, 最終促進瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的消化。

3.3 復(fù)合酶制劑對奶牛DMI和FCR的影響

提高DMI和FCR對于改善動物生產(chǎn)性能和降低飼養(yǎng)成本具有重要意義。解祥學(xué)等報道, 酶制劑具有降低消化道食糜黏性、增加采食量的作用。Choct研究表明, 飼糧中添加酶可以降低禽類消化道內(nèi)食糜黏性, 若酶在反芻動物上也有類似降低消化道內(nèi)食糜黏性的特點, 就能夠增加瘤胃食糜的流通速率, 使反芻動物的飽腹感減弱, 從而促進奶牛采食;但如果增加食糜的流通速率, 酶在瘤胃中停留時間減少, 就會導(dǎo)致酶缺乏足夠時間來降解瘤胃中纖維物質(zhì), 而隨瘤胃食糜排出的絕大部分酶在真胃環(huán)境中胃蛋白酶和低pH作用下很快失活, 因此, 酶制劑的添加水平需要控制在合理的范圍內(nèi)。在本試驗中, 飼糧中添加0.10%和0.15%的復(fù)合酶制劑能顯著提高奶牛的FCR, 使DM I有升高的趨勢, 說明復(fù)合酶制劑可在一定程度上促進奶牛采食。

3.4 復(fù)合酶制劑對奶牛血清生化指標(biāo)的影響

血液中ALB、TP、UN和CR含量變化共同反映了機體蛋白質(zhì)代謝情況。血液中TP主要由ALB和球蛋白構(gòu)成, ALB具有維持血漿的滲透壓的作用, 奶牛血液中ALB正常含量在29.0~36.6 g/L, 若其長時間含量過低, 則會導(dǎo)致機體蛋白質(zhì)缺乏;血液中的UN主要來自于飼糧中蛋白質(zhì)分解和機體蛋白質(zhì)分解, 當(dāng)血液中UN含量升高時, 則表示機體增強了對飼糧蛋白質(zhì)的利用能力, 提高了機體對蛋白質(zhì)的分解作用, 反之則下降, 因此血液中UN含量變化可在一定程度上反映機體對飼糧中蛋白質(zhì)的利用情況;血液中CR含量反映了機體蛋白質(zhì)分解和肝臟中氮素循環(huán)的情況, CR含量增加代表著機體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝活動增強。賈仙寶報道, 在飼糧中添加纖維素酶制劑使血液中TP、CR含量顯著升高, UN含量降低, 表明酶制劑能夠影響參與蛋白質(zhì)代謝的相關(guān)血液指標(biāo);扈添琴在飼糧中添加酶制劑與植物甾醇復(fù)合物能提高ALB含量, 但對TP含量沒有顯著影響。在本試驗中, 添加復(fù)合酶制劑, 血清中TP含量有升高趨勢, UN含量有下降趨勢, 但未達到顯著水平, 這可能由于奶牛本身具有較強的自身調(diào)控能力。

TC和BHBA是脂肪代謝產(chǎn)物, 因此其含量變化可在一定程度上反映機體內(nèi)脂肪代謝情況。扈添琴研究發(fā)現(xiàn), 添加酶制劑和植物甾醇復(fù)合物使奶牛血液中TC和甘油三酯含量降低;林靜等發(fā)現(xiàn), 在飼糧中添加外源纖維素酶對血清中TC、BHBA含量均沒有顯著影響, 這與本試驗結(jié)果一致。

血液中的GLU主要來源于體內(nèi)肝糖原的分解和瘤胃微生物分解飼糧中碳水化合物產(chǎn)生的丙酸, 是機體主要的能量來源, 其含量反映機體對飼糧碳水化合物消化吸收能力的強弱。奶牛血液中GLU的正常含量為 (3.10±0.47) mmol/L。在本試驗條件下, 飼糧中添加復(fù)合酶制劑對奶牛血清GLU含量沒有顯著影響, 但在數(shù)值上有所提高, 這與賈仙寶結(jié)果一致。

3.5 復(fù)合酶制劑對奶牛生產(chǎn)性能的影響

產(chǎn)奶量直接影響了奶牛生產(chǎn)效益, 如何添加酶制劑提高奶牛的產(chǎn)奶量也是當(dāng)前的研究熱點。林靜等在飼糧中添加以纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶為主的復(fù)合酶制劑飼喂奶牛, 結(jié)果表明添加10和20 g/ (頭·d) 的復(fù)合酶制劑能顯著提高產(chǎn)奶量;Yang等通過在奶牛飼糧中添加0.1%和0.2%的酶制劑使產(chǎn)奶量顯著提高了0.9和1.9 kg/d, 4%乳脂校正乳產(chǎn)量顯著提高了0.5和2.2 kg/d, 同時表明產(chǎn)奶量和4%乳脂校正乳產(chǎn)量的提高幅度隨添加量的增加而增加;而Silva等的研究結(jié)果顯示酶制劑對奶牛產(chǎn)奶量沒有顯著影響。本試驗發(fā)現(xiàn), 0.10%組和0.15%組的3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量比對照組顯著提高, 且試驗組的產(chǎn)奶量也有增加的趨勢, 這可能是由于復(fù)合酶制劑促進了瘤胃發(fā)酵, 提高了營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率和FCR, 從而增加了產(chǎn)奶量和3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量。在本試驗中, 隨著復(fù)合酶制劑量增加, 3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量呈二次變化, 這說明3.5%乳脂校正乳產(chǎn)量與復(fù)合酶制劑添加量密切相關(guān)。

乳脂率、乳蛋白率和乳糖率含量是評價牛奶品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。Sutton等研究發(fā)現(xiàn), 飼糧中添加復(fù)合酶制劑能夠有效改善乳品質(zhì);Beauchemin等在飼糧中添加1.22和3.67 mL/kg的液體酶制劑飼喂奶牛, 結(jié)果表明乳蛋白率顯著高于對照組, 分別提高了1.82%和2.13%;楊澤坤等通過在飼糧中添加復(fù)合酶制劑飼喂奶牛發(fā)現(xiàn), 乳脂含量和乳蛋白率均得到顯著提高;而Arriola等報道飼糧中添加酶制劑對乳品質(zhì)沒有顯著影響。本試驗結(jié)果表明, 飼糧中添加0.10%和0.15%的復(fù)合酶制劑使牛奶乳脂率比對照組顯著提高了7.30%和12.70%。這可能是由于飼糧中復(fù)合酶制劑提高了瘤胃內(nèi)乙酸菌和纖維分解菌等微生物的活動, 瘤胃微生物活動的增強促進瘤胃液中VFA和乙酸的產(chǎn)生, 而乙酸是合成乳脂的重要前體物質(zhì), 因此大量乙酸的產(chǎn)生有利于促進乳脂合成。在本試驗中, 隨著復(fù)合酶制劑量增加, 乳脂率呈二次變化, 這可能是由于復(fù)合酶制劑量與微生物總量之間存在二次變化的關(guān)系, 過量的復(fù)合酶制劑反而對產(chǎn)奶性能有負面作用。