我國農業生產所產生的農作物秸稈和尾菜面廣量大，但資源化利用率較低，是目前農業面源污染源之一；同時，我國的養殖飼料資源相對短缺。因此，秸稈和尾菜的資源化對農業生產生態環境治理和飼料資源開發有雙重意義。據2013年中國統計年鑒報道，我國蔬菜的種植面積和產量分別占世界的43%和49%，2015年我國蔬菜產量達7.8億t，較2012年增長10.8%，年均增長3.6%。李東霞等認為，蔬菜生產中廢棄的尾菜約為20%—67%，推算2015年我國蔬菜尾菜產量為1.56—5.23億t。另外，我國每年可生產秸稈7億t以上，其中每年水稻秸稈產量大約為2.4億t。目前，秸稈的資源化利用率也較低，其中，約33%廢棄或露天焚燒、約20%作為生活燃料、僅約15%作為飼料。可見，尾菜和秸稈的資源化利用有待進一步研究。

青貯技術可飼料化處理尾菜或秸稈，但由于農作廢棄物各自的營養特點，單獨青貯效果不佳。稻草秸稈的水分含量是15%，白菜尾菜水分含量是94.70%。若單獨青貯，可能會由于水分含量過低或過高導致青貯效果不佳。依據養分搭配進行混合青貯則可在一定程度上改善青貯效果。李海玲等將白菜尾菜和小麥秸稈按一定比例進行混合發酵，增加了兩者飼料化的可利用性。戴洪偉等將玉米秸稈和蓮花菜尾菜利用酵母菌進行發酵，提高了原物料中粗脂肪和粗蛋白質含量。綜上，混合青貯不僅可以獲得較高營養價值的飼料，還可合理配置資源并節約處理成本。鑒于我國水稻和白菜栽培面積都較為廣泛，為了更好地開發非飼料資源和緩解農廢環境問題，本課題組前期采用不同添加劑對稻草和白菜尾菜進行了混合青貯，經測定提高了飼料的營養價值，但其對瘤胃發酵性能的影響還有待進一步研究。為此，本試驗擬通過體外模擬瘤胃發酵，研究稻草和白菜尾菜的混合青貯飼料對瘤胃體外發酵的影響，以進一步篩選適宜于反芻動物瘤胃微生物發酵的復合青貯飼料，為今后飼養試驗的開展及其在動物生產中的應用技術研發提供試驗資料。

在揚州大學實驗農牧場選取4頭健康狀況良好、體況相近且裝有永久性瘤胃痰管的綿羊，用于提供體外模擬瘤胃發酵試驗所需的瘤胃液。試驗用綿羊的精飼料為玉米和豆粕，粗飼料為燕麥草，精粗比為4:6。每日07:00和19:00等量飼喂，自由飲水。

在前期L9（3³）三因素三水平正交設計青貯試驗基礎上，篩選出青貯45d且青貯質量較好的3個處理組，以未加添加劑處理的青貯飼料為對照組（表1），進行體外模擬瘤胃微生物發酵試驗。每組各設置3個重復，并設置空白組。培養開始后，分別在0、12、24、36h采集培養液樣品并測定pH，以進一步篩選出適合瘤胃發酵的青貯飼料優選組。

參照王加啟的研究方法配制人工瘤胃緩沖液所需的溶液A、溶液B、溶液C、還原劑、刃天青溶液。試驗前按以下比例配制瘤胃緩沖液：向400mL蒸餾水中分別加入0.1mL 溶液A.200mL 溶液B.200mL 溶液C.1mL刃天青溶液和40mL還原劑，將以上溶液混勻通入CO₂至飽和，并預熱至39℃。于晨飼前從4只瘺管羊瘤胃中采集瘤胃液，混勻后用4層紗布過濾，裝入39℃預熱且充滿CO₂的保溫瓶中后迅速帶到實驗室，置于39℃水浴鍋中保溫并向瘤胃液中持續通入CO₂以待接種。稱取0.4g底物樣品于培養瓶中，每組3個重復。將20mL瘤胃液和40mL緩沖液迅速加入培養瓶中，并向瓶中通入CO₂后將培養瓶置于39℃的恒溫振蕩水浴鍋中培養。在0，12，24，36h進行樣品采集，即時測定pH；將1mL培養液加入1mL原蟲染色液MFS中，搖勻后靜置以用于原蟲計數；用濾袋過濾殘渣并收集過濾出的培養液，分裝保存于-80℃，以待氨氮和微生物蛋白濃度的測定。殘渣經洗滌和烘干后用于測定酸性洗滌纖維（ADF）降解率。

采用梅特勒一托利多（FE20）pH計檢測pH。參照Broderick等的苯酚一次氯酸鈉比色法測定氨氮濃度。參照蘇海涯的方法測定培養液中微生物蛋白濃度。首先采用酵母RNA進行標準曲線的制作，再根據標準曲線計算出RNA測定值，最后根據公式計算微生物蛋白濃度：

微生物蛋白濃度(mg/mL)=RNA測定值(mg/mL)xRNA含氮量(17.83%)X稀釋倍數X6.25/細菌中RNA含氮量(10%)。

參照王夢芝等的方法進行原蟲計數。將采集后的培養液立刻用MFS染色液染色，采用血球計數板進行計數。計算公式：

原蟲數（個/mL）=N/4 X D X 16 X 10 X 1000=N X D X 4 X 104

其中，N為計數4個中方格的總數；D為稀釋倍數。

參考張麗英的《飼料分析及飼料質量檢測技術》（第三版）測定培養前和36 h培養后ADF含量，并計算ADF的36h降解率。

采用Excel 2013對試驗數據進行初步整理，再采用SPSS 16.0對不同指標進行單因素方差分析，并用Duncan，s法進行多重比較。差異顯著水平判斷標準為P<0.05。

由表2可知，各組底物在培養試驗期間pH在6.77—6.94。其中，36h時，1組顯著高于其他各組。

由表3可知，總體上各組氨氮濃度在20.09—44.39mg/100mL。其中24h和36 h時組間都有顯著差異。12h時的氨氮濃度為1組>2組>對照組>3組，1組顯著高于3組；24h時為2組>3組>1組>對照組，3個處理組均顯著高于對照組；36h時為3組>2組>1組>對照組，2組、3組顯著高于對照組。培養期間培養液氨氮濃度的均值則以2組相對較低。

由表4可知，整體上各組皆以24h時微生物蛋白濃度最高。不同處理的青貯飼料對瘤胃體外微生物蛋白濃度有顯著影響。其中，0h和24h組間差異不顯著，12h和36h時皆以2組的微生物蛋白濃度最高，且培養期微生物蛋白濃度的均值以2組最高。另外，3個處理組ADF的36h降解率均高于對照組，且以3組最高，顯著高于對照組。

由表5可以看出，各組的原蟲密度隨培養時間呈先上升后下降的動態趨勢，整體上在12h時各組原蟲密度普遍達到最高值。36h時，2組和3組顯著高于對照組。培養期原蟲密度的均值以3組最高，2組次之。

瘤胃微生物蛋白是反芻動物宿主蛋白質的主要供應來源，且能夠提供反芻動物所需蛋白質的40%—80%。

pH是反映瘤胃發酵情況的重要指標，反芻動物瘤胃微生物生長適宜的pH范圍為6－7，微生物蛋白合成適宜的pH范圍為6.3—7.4。本研究中各組培養液pH（6.77—6.94）均在瘤胃微生物生長和微生物蛋白合成的適宜范圍。本研究中以第2組的微生物蛋白濃度較高，這可能是由于其青貯效果較好，可利用養分含量較高以及底物養分降解率較高所致。本課題組前期檢測表明，第2組的45d青貯的樣品其可溶性糖含量（對照組、1組、2組、3組可溶性糖含量分別為1.93%、1.78%、2.20%、2.12%)和粗蛋白質含量（對照組、1組、2組、3組的粗蛋白質含量分別為5.28%、7.66%、7.50%、6.81%）在各處理組中都相對較高；而ADF含量則相對較低（對照組、1組、2組、3組的ADF含量分別為39.50%、33.48%、31.56%、32.62%），在利于微生物的生長方面有一定的一致性。同時，第2組ADF的36h降解率也相對較高，都說明第2組的處理較有利于瘤胃微生物的生長。

氨氮濃度可以在一定程度上反映瘤胃微生物對蛋白質降解和對氨氮利用的程度。過高會超過瘤胃微生物所需氨氮的最大濃度，多余的氨氮積累不利于瘤胃微生態環境的平衡和微生物的生長。本研究發現，氨氮濃度在培養期一直上升，在24h時氨氮濃度達到瘤胃微生物適宜生長的最大濃度，所以在12—24h時的微生物蛋白濃度也在所測定時間點中較高。但在36h氨氮濃度超過了適宜微生物的濃度，這可能是由于體外培養沒有代謝物外移使得氨氮濃度不斷積累，其積累超過一定程度則可能抑制微生物的生長。本研究結果也表明，在24—36h時微生物蛋白的濃度有所下降。組間以第2組的氨氮濃度較低，可能是所使用的發酵飼料更適宜于微生物生長，從而使得微生物對氨氮利用較多所致，第2組的微生物蛋白濃度較高也說明了這一點。

瘤胃原蟲在維持瘤胃微生態平衡、促進纖維物質和蛋白質利用、降低硝酸鹽和亞硝酸鹽毒性等方面都至關重要，同時其活性和數量也受培養底物以及培養液環境多種因素的影響。本研究中，原蟲密度隨著培養時間的延長有所增加，至12h達到最高值。這表明12h時培養液環境較適宜于其生長，而后發酵的持續和代謝物的積累抑制了其增殖。另有研究表明，原蟲有可溶性糖趨向性，在吞噬淀粉等底物后會隱匿在秸稈或瘤胃腹囊部，在下一次宿主采食時再次回到瘤胃液中吞噬底物。這可能是本研究中12h原蟲密度達到最高之后又有所下降的原因之一。本研究中，以2組和3組的原蟲密度較高，可能與上述兩組的可溶性糖含量（對照組、1組、2組、3組的可溶性糖含量分別為1.93%、1.78%、2.20%、2.12%）較高有關。

本試驗中，第2組青貯飼料的瘤胃微生物蛋白濃度較高，而且其原蟲密度較高、氨氮濃度較低。說明稻草秸稈與白菜尾菜比例為4:6混合青貯時，采用植物乳桿菌0.035g/kg、纖維素酶0.250g/kg的組合處理，能夠獲得品質較好且適宜于體外培養瘤胃微生物的發酵。