發酵銀杏葉對斜帶石斑魚生長性能、血漿生化指標與肝臟抗氧化指標的影響

2021-06-17 14:51:24 點擊：

摘要：本試驗旨在研究發酵銀杏葉對斜帶石斑魚生長性能、血漿生化指標與肝臟抗氧化指標的影響。配制添加不同水平[0（對照）、0.25%、0.50%]發酵銀杏葉的飼料,投喂初始體重為12.6g的斜帶石斑魚8周,每種飼料投喂3個網箱（重復）,每個網箱投放30尾魚。結果顯示:

1）生長性能指標各組間均沒有顯著差異（P>0.05）。

2）與對照組相比,飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉均可顯著降低血漿谷丙轉氨酶（ALT）活性（P<0.05）；飼料中添加0.50%發酵銀杏葉還可顯著降低血漿谷草轉氨酶（AST）活性（P<0.05）。

3）與對照組相比,飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉均可顯著降低肝臟丙二醛（MDA）含量（P<0.05）,顯著提高肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性（P<0.05）；飼料中添加0.50%發酵銀杏葉還可顯著提高肝臟過氧化氫酶（CAT）活性（P<0.05）。由此可見,飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉對斜帶石斑魚的生長性能無負面影響,還可提高斜帶石斑魚的肝臟抗氧化能力,且添加水平為0.50%時效果優于添加水平為0.25%時。

斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）是鱸形目（Perciformes）鮨科（ Serranidae）石斑魚屬（Epineph-elu）的一種名貴的海水經濟魚類,在我國福建、廣東與海南等地廣泛養殖,具有較高的經濟價值。近年來,隨著養殖規模的逐步擴大,海區水質的變化以及不合理使用化學藥等問題導致養殖斜帶石斑魚成功率低、效益差,因此研究開發新型飼料添加劑對石斑魚養殖業的健康可持續發展有重要意義。據已有研究表明,藥用植物中的活性成分以黃酮類、多糖與萜類內酯化合物為主,可以通過提高機體抗氧化能力、抑制腫瘤壞死因子釋放和抑制細胞凋亡等作用對機體施加影響。發酵藥用植物能夠提高藥效,減少副作用,消除不良味道,具有廣闊的發展前景。研究表明微生物發酵能夠降低銀杏葉中的銀杏酸等毒性成分,從而降低毒副作用,同時提高黃酮類與萜類內酯化合物的比例,從而提高藥效。研究發現,在團頭魴飼料中添加發酵銀杏葉能夠提高其生長性能、腸道消化酶活性、免疫能力及抗氧化能力；一定比例的銀杏葉一辣木葉發酵物能夠作為飼料蛋白質源替代異育銀鯽飼料中的魚粉,并且可提高增重率與肝臟抗氧化能力。但發酵銀杏葉在斜帶石斑魚飼料中的應用研究尚鮮有報道,本實驗室前期的研究已在細胞水平證實發酵銀杏葉對于石斑魚的肝臟細胞具有較好地保護作用,但缺乏體內試驗的驗證。因此,本試驗通過投喂斜帶石斑魚添加不同水平發酵銀杏葉的飼料,探究發酵銀杏葉對斜帶石斑魚生長性能、血漿生化指標和肝臟抗氧化指標的影響,為發酵銀杏葉在斜帶石斑魚飼料中的應用提供理論依據。

材料與方法

1 試驗動物

斜帶石斑魚幼苗,購買于福建省漳州市漳浦縣某石斑魚育苗場。

2 試驗材料

銀杏葉購于廈門市某大藥房,短小芽孢桿菌由某大學水產學院動物營養與飼料實驗室饋贈。按李澤鑫等的方法,用淺盤培養法制備發酵銀杏葉。

3 試驗飼料的制備

以魚粉、大豆濃縮蛋白作為蛋白質源,魚油、大豆磷脂作為脂肪源,制作基礎飼料,在基礎飼料中分別添加0（對照組）、0.25%（試驗1組）、0.50%（試驗2組）的發酵銀杏葉配制試驗飼料,制成直徑為2.5mm的顆粒飼料,保存于-20℃冰箱待用。試驗飼料組成及營養水平見表1。

4 飼養管理與樣品采集

試驗魚暫養2周后,挑選大小基本一致、鱗片完整且采食正常的斜帶石斑魚270尾,初始體重為12.6g,隨機放入9個體積為100cm×60cm×80cm的網箱中,每個網箱30尾。將9個網箱同置于一個長方形水泥池中,隨機分成3組,每組3個網箱（重復）。飼養試驗持續8周,每天08:00和16:00進行飽食投喂,每2d進行1次吸糞,養殖水源為過濾海水,水溫22.5-30.0℃,溶解氧濃度大于5.7mg/L。

養殖試驗結束后,經過24h禁食,將每個網箱的試驗魚分別撈出稱重,每個網箱隨機撈取6條魚用MS-222麻醉,尾靜脈采血,全血（01%肝素鈉抗凝）收集在離心管中,離心（2500m/min）10min后收集血漿,于-80℃冰箱保存；采血后解剖取肝臟稱重后于-80℃冰箱保存。

5 指標測定

5.1 生長性能指標

根據試驗所測定和記錄的數據計算增重率（weight gain rate,WGR）、特定生長率（specific growth rate,SGR）、攝食率（daily feeding intake,DFI）飼料效率（feed efficiency ratio,FER）、肝體比（hepaticsomatic index,HSI）、成活率（survivalrate,SR）。生長性能指標的計算公式如下：

增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0；

特定生長率（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t；

攝食率（%/d）=100×Wf/（Wt/2+W0/2）/t；

肝體比（%）=100×W1/Wt；

成活率（%）=100×Nf/Ni。

式中:W0為試驗魚的初始體重（g）；Wt為試驗魚的終末體重（g）；Wf為攝食飼料的總量（g）；W1為肝臟重量（g）；t:為投喂天數（d）；Ni為試驗初始魚尾數；Nf為試驗終末魚尾數。

5.2 血漿生化指標

血漿堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性與總膽固醇（T-CHO）、總蛋白（TP）含量采用相應試劑盒測定,試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

5.3肝臟抗氧化指標

肝臟過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量采用相應試劑盒測定,試劑盒購于南京建成生物工程研究所。肝臟蛋白質含量采用喹啉酸（BCA）法蛋白質定量測試盒測定,測試盒購于南京建成生物工程研究所。

6 數據處理與分析

試驗數據用平均值±標準誤（mean±SE）表示。采用SPSS 20.0軟件進行數據統計和分析,先對數據進行方差齊性檢驗,如滿足方差齊性條件則對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA）,若組間存在顯著性差異,則采用 Duncan氏法進行多重比較檢驗組間差異顯著性,以P<0.05表示差異顯著。

結果

1 飼料中添加不同水平的發酵銀杏葉對斜帶石斑魚生長性能的影響

由表2可知，包含增重率、特定生長率、肝體比在內的各生長性能指標在各組之間均沒有顯著差異（P>0.05）。

2 飼料中添加不同水平的發酵銀杏葉對斜帶石斑魚血漿生化指標的影響

由表3可知,飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉對斜帶石斑魚血漿中AKP活性與T-CHO、TP含量均無顯著影響（P>0.05）。與對照組相比，飼料中添加0.25%發酵銀杏葉對血漿中AST活性沒有產生顯著影響（P>0.05）,但添加0.50%發酵銀杏葉則使血漿中AST活性顯著下降（P<0.05）；此外,飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉均可顯著降低血漿中ALT活性(P<0.05)。

3 飼料中添加不同水平的發酵銀杏葉對斜帶石斑魚肝臟抗氧化指標的影響

由表4可知,添加發酵銀杏葉的2個試驗組的肝臟SOD活性均顯著高于對照組(P<0.05),且肝臟SOD活性有隨發酵銀杏葉添加水平增加而升高的趨勢;肝臟GSH-Px活性隨著發酵銀杏葉添加水平的增加而顯著升高(P<0.05);肝臟CAT活性在發酵銀杏葉添加水平為0.50%時達到最高,顯著高于未添加發酵銀杏葉和發酵銀杏葉添加水平為0.25%時（P<0.05）；飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉均使得肝臟MDA含量較對照組顯著降低（P>0.05）。

討論

逯巖等發現在團頭魴飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉均能夠顯著提高團頭魴幼魚的增重率與特定生長率,并可降低飼料系數。而在本試驗中,在斜帶石斑魚飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉,對其增重率、特定生長率、攝食率與成活率均未產生顯著影響。Tan等在石斑魚的高脂飼料中添加0.05%～0.40%銀杏葉提取物并未顯著改變其增重率、特定生長率、攝食率與成活率,與本試驗結果類似。這可能是由于石斑魚屬于肉食性魚類,飼料中會添加高比例的魚粉來提高飼料中蛋白質的品質,使得石斑魚的生長性能達到較高水平,再提高較難,這說明發酵銀杏葉在石斑魚上呈現出的主要作用可能在于提高免疫能力或抗氧化能力方面,并且在0.25%與0.50%添加水平下不會對其生長性能產生負面影響。

血液中T-CHO的含量能夠在一定程度上揭示魚體脂類代謝的情況,反映肝臟的健康程度,當魚體脂肪代謝紊亂、肝臟受到損傷時,血液中T-CHO的含量往往會升高,Yan等研究發現,銀杏多糖能夠抑制非酒精性脂肪肝引發的代謝紊亂；Jeong等研究表明,銀杏葉提取物有減少脂類在肝臟過度沉積的作用；Tan等在珍珠龍膽石斑魚的高脂飼料中加入0.05%-0.20%銀杏葉提取物后,顯著降低了血液中甘油三酯（TG）、T-CHO與肝臟粗脂肪含量；而本試驗中,在斜帶石斑魚飼料中添加0.25%或0.50%發酵銀杏葉后,相比對照組,肝體比有降低的趨勢,血漿T-CHO含量有所下降,且有隨著添加水平的增加而降低的趨勢,但差異均未達到顯著水平,可能是本試驗中各試驗飼料中碳水化合物、粗脂肪等營養成分含量適中,故未形成顯著差異。此外,本試驗發現,飼料中添加發酵銀杏葉有降低中血漿AKP活性、T-CHO與TP含量的趨勢,表明發酵銀杏葉中的活性成分有影響機體蛋白質合成與脂肪代謝的作用,降低無機磷源的吸收與營養物質的轉運效率，如果過量添加可能會影響魚體正常的生長發育。

AST與ALT是肝臟內的2類重要的轉氨酶，在氨基酸的代謝中起重要作用,當肝細胞結構受到破壞時,AST與ALT作為肝細胞的胞內酶,進入到血液中,所以血液中AST與ALT的活性可以代表肝臟的健康狀態。張碩等的研究發現藥用植物所含的黃酮類化合物具有抗四氯化碳（CCl4）致小鼠肝纖維化的作用，能夠顯著降低小鼠血液中AST與ALT活性,而黃酮類化合物又是發酵銀杏葉中的主要成分之一。本試驗中,在斜帶石斑魚飼料中添加0.25%的發酵銀杏葉時,血漿中AST活性相對對照組略有下降而ALT活性則顯著降低,發酵銀杏葉添加水平為0.50%時,血漿中AST與ALT活性相對對照組均顯著降低,說明發酵銀杏葉具有維持斜帶石斑魚肝臟細胞正常結構與功能的作用,但同時也降低了氨基轉移活力,這也是添加發酵銀杏葉未能提高斜帶石斑魚生長的原因之一。

機體中的SOD能夠催化超氧陰離子（O2-）歧化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）；GSH-Px是一種在還原過氧化物過程中起重要作用的酶,能夠降低過氧化物對機體的傷害；體內產生的H2O2經過CAT催化分解或利用,避免氧化損傷；MDA是具有細胞毒性的物質,是體內過氧化過程的最終產物,其含量的升高反映體內抗氧化能力。曹建等的研究表明,銀杏葉有降低血液MDA含量與提升SOD活性的作用；太海燕等的研究發現,銀杏葉提取物可以通過降低肝臟MDA含量緩解小鼠的急性酒精性肝損傷,Niu等的研究表明在肉雞飼糧中添加發酵銀杏葉可以提升肝臟GSH-Px和SOD活性,從面提高肉雞肝臟的總抗氧化能力。本試驗數據顯示,攝食添加發酵銀杏葉飼料的斜帶石斑魚,其肝臟SOD、GSH-Px、CAT活性顯著高于對照組，MDA含量顯著低于對照組,且0.50%添加水平較0.25%添加水平作用更為明顯,表明發酵銀杏葉對于提升斜帶石斑魚清除自由基能力與抗氧化能力有顯著作用,這可能是銀杏葉中的有效生物活性成分黃酮類、銀杏多糖與萜類內酯化合物共同發生作用的結果,其具體機制還有待進一步研究。

在我們前期的離體試驗中發現,發酵銀杏葉對H2O2誘導的斜帶石斑魚肝細胞損傷具有顯著的保護作用,能夠顯著降低細胞上清液中AST與ALT的活性,并顯著提高細胞GSH-Px活性與總抗氧化能力,顯著降低細胞MDA含量,本試驗結果進一步印證了離體試驗的結果。

結論

飼料中添加發酵銀杏葉并未對斜帶石斑魚的生長性能產生負面影響,還能夠提高斜帶石斑魚的肝臟抗氧化能力,且添加水平為0.50%時效果優于添加水平為0.25%時。

【產品特點】本品是專門針對水生動物的生理特性而設計的復合益生菌與復合酶制劑，特別是針對水生動物類消化系統的特點，采用原籍高活力乳酸菌，其抗逆性強，具有很強的活力，從而能夠達到滿意的使用效果。連續使用本品后能夠提高魚類的采食量和提高消化吸收率，不僅健康問題明顯減少，死亡淘汰率降低，且增長、增重效果非常明顯（對比數據顯示：相同的飼料和規格的草魚，連續使用本品后提前半月左右達到規定的重量），并且能夠改善魚類肉品質，提高經濟效益。

【性狀】灰白色或淡黃色粉末。

【適用范圍】高密度網箱養殖、高密度魚塘養殖、水庫養殖等各種水產動物，在四大家魚、羅非魚、海參、鮑魚、鰻魚、泥鰍、黃鱔、蝦類、龜鱉、蛙類等特種魚類養殖上均反饋效果明顯。廣泛適用于海水、淡水養殖。

【主要功效】

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2.促進消化吸收，降低飼料消耗：益生菌代謝產物中具有豐富的消化酶，可以提高飼料消化吸收率，使魚類充分利用飼料中的營養，促進魚類健康增長和增重效果顯著。

3.改善水質：連續使用本品，可以降解養殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質，快速調節水質，保持水質“肥、活、嫩、爽”。快速分解水體中的殘餌、糞便、動植物殘骸等有機廢物，消除水體臭味異味，凈化水質、改善水色、提高透明度、修復塘底、快速解毒，保持水環境生態平衡，有利于養殖品種生長發育。

4.使用本品后可有效減少或不使用抗生素，改善水生動物肉質，提高成活率，養殖品種色澤好，活力強，整齊度高，肉質好，能形成水生動物健康生態養殖模式，提高商品性能，生產健康安全的水生動物產品。

本品所用菌株穩定性好，抗逆性強，具有耐熱、耐酸、耐膽汁、無污染、無違禁物質、綠色環保的特點，可長期使用。

【用法用量】

1.喂粉狀飼料時，直接添加到飼料中；喂粒狀飼料時，可將本品1包加水2-5公斤溶解后與部分（50-100公斤）先飼喂，再飼喂未添加益生菌的飼料；或將溶解的益生菌灑在全部（500公斤）顆粒料上簡單混合一下后投喂。

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2.喂濾食性水生動物或貝類，可將本品用養殖池塘水浸泡3小時以上（浸泡活菌的水最好加入1%的糖）直接潑撒；喂蛙類時由于是懸浮膨化飼料，需要將本品先放入5公斤清水中激活6小時以上（放入500g紅糖效果更好，激活24小時效果最佳），然后將激活的菌液灑在50-100公斤飼料中先飼喂，剩余的400-450公斤飼料正常飼喂，目的是將益生菌加入到其中。