1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

濃醬兼香型酒醅樣品：采自湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司釀酒車間（第三輪次、第四輪次、第五輪次和第六輪次），各輪次的入池和出池酒醅樣品采集數(shù)量均為2份，各酒醅樣品pH值在3.2～4.5之間。

1.1.2 化學(xué)試劑

溶菌酶（20000U/mg）：蓋云天（武漢）生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DNA聚合酶（5U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏（均為生化試劑）：安琪酵母有限公司；葡萄糖、吐溫80、磷酸氫二鉀、無(wú)水乙酸鈉、乙酸、檸檬酸氫二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、叔戊醇（均為色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖5g、無(wú)水乙酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫-801mL、七水硫酸鎂0.2g、一水硫酸錳0.05g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至6.5～6.8，分裝滅菌，115℃高壓滅菌30min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20g，115℃高壓滅菌30min。

改良MRS固體培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中添加1.5%的CaCO3。

酸度耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用乙酸-乳酸（1∶1，V/V）混合酸調(diào)整其pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5。

乙醇耐受性培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按體積分?jǐn)?shù)分別加入2%、4%、6%、8%、10%的無(wú)水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE80i相差顯微鏡：日本Nikon公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)、ZXDP-A2160全自動(dòng)新型電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；T3000PCR儀：德國(guó)Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀：美國(guó)Syngene公司；UV-5900PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-50Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1260c高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分離

稱取不同輪次酒醅樣品10g，加入90mL無(wú)菌水中，30℃、170r/min搖床振蕩0.5h，經(jīng)系列稀釋后，取適當(dāng)稀釋度的菌液各1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，封口，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱72h靜置培養(yǎng)。待乳酸菌長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取形態(tài)不同的單菌落，在改良MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次，挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)硫化氫實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏染色呈陽(yáng)性且過(guò)硫化氫實(shí)驗(yàn)呈陰性的菌株初步確定為乳酸菌。分離乳酸菌時(shí)MRS培養(yǎng)基中均添加100U/mL制霉菌素，以抑制酒醅中酵母菌的生長(zhǎng)。

1.3.2 濃醬兼香型酒醅乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取純化后的乳酸菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃、靜置培養(yǎng)48h，用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，完成后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ苑蛛x菌株的基因組DNA為模板，采用乳酸菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）與1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)其16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×Power Taq MaserMix 25μL，DNA模板1μL，引物27F和1492R各1μL，雙蒸水（ddH2O）22μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，54℃退火50s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取1400bp左右的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。采DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)。校正以后的序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，比較測(cè)試菌株和已知乳酸菌菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，用DNAMAN6.0校準(zhǔn)排齊序列，采用MEGA5.2軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法，1000次Bootstrap檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 不同輪次布氏乳桿菌生長(zhǎng)特性的測(cè)定

耐酸能力的測(cè)定：挑取布氏乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，進(jìn)行活化。按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)24h，作為種子液。將種子液按1%（V/V）的接種量分別接種到不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液的OD600nm值。

耐乙醇能力的測(cè)定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量分別接種于含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，30℃靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液的OD600nm值。

耐高溫能力的測(cè)定：將布氏乳桿菌種子液按1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量20mL/25mL，分別在37℃、41℃、45℃、50℃條件下，靜置培養(yǎng)48h，將菌液稀釋一定倍數(shù)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液的OD600nm值。

1.3.4 不同布氏乳桿菌株液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將布氏乳桿菌種子液按2%（V/V）的接種量接種于200mL MRS液體培養(yǎng)基，搖勻，用無(wú)菌不透氣保鮮膜封口，密閉，28℃恒溫靜置發(fā)酵3d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過(guò)膜處理，采用高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物差異。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸的測(cè)定

取布氏乳桿菌發(fā)酵液，渦旋振蕩混勻，直接用5mL的注射器（不帶針頭）取不同菌株發(fā)酵液5mL，先用0.45μm有機(jī)濾膜初步過(guò)濾，再用0.22μm有機(jī)濾膜注入2mL的液相進(jìn)樣瓶中，每一個(gè)處理?xiàng)l件平行三次。采用高效液相色譜法檢測(cè)有機(jī)酸，HPLC條件：Bio-RadAminexHPX-87H色譜柱（300mm×7.8mm×9μm），柱溫30℃，檢測(cè)器二極管陣列紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流速0.6mL/min，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相為4mmol/L硫酸溶液。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)SPSS22.0軟件分析不同樣本間是否存在顯著性差異，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用Tukey方法，假設(shè)樣本間方差相等，若Tukey HSD檢驗(yàn)P＞0.05則無(wú)顯著性差異；0.01＜P＜0.05則差異顯著；P＜0.01則差異極顯著。

2結(jié)果與分析

本研究從濃醬兼香型不同輪次的酒醅中共分離到30株乳酸菌，歸屬于3個(gè)屬共5個(gè)種，分別為布氏乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌，其中布氏乳桿菌（L.buchneri）最多，為21株，占總分離菌株數(shù)的70%，是第三、第四輪出池酒醅中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

不同輪次酒醅中分離的19株L.buchneri的耐酸、耐乙醇和耐高溫生長(zhǎng)能力存在一定差異，最適生長(zhǎng)pH值大多在4.5左右，其中，菌株ZS-B3、ZS-B9和ZS-B10耐酸性較好，pH4.0條件下培養(yǎng)48h后，OD600nm值可以達(dá)到0.2；對(duì)乙醇的耐受能力在2%～10%之間，約有50%的菌株乙醇耐受能力達(dá)到6%，其中菌株ZS-B18和ZS-B16乙醇耐受能力最強(qiáng)，在含10%乙醇的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，OD600nm值仍能達(dá)到0.7；最適生長(zhǎng)溫度均為37℃，在41℃條件下，L.buchneri生長(zhǎng)均受到抑制，當(dāng)溫度升高到45℃時(shí)，所有菌株均停止生長(zhǎng)。

6株布氏乳桿菌代表菌株表現(xiàn)出了較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸和乙酸的能力。其平均檸檬酸產(chǎn)量為3.761g/L，平均乙酸產(chǎn)量為4.222g/L，分別是L. plantarum ZR1的11.13倍和1.80倍。檸檬酸是良好的食物酸味劑，具有抗氧化、增加酸味、抑制細(xì)菌等作用。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒中主要呈香物質(zhì)乙酸乙酯的形成又與乙酸有直接相關(guān)。對(duì)布氏乳桿菌在白酒發(fā)酵系統(tǒng)中的存在狀態(tài)及其功能進(jìn)行研究，對(duì)于調(diào)控白酒中檸檬酸和乙酸乙酯含量具有一定的指導(dǎo)意義。