堿性蛋白酶酶解豆粕及對其品質(zhì)改善的研究表明品質(zhì)得到改善，利用率高，飼喂動物效果好

2022-08-10 16:28:43 點(diǎn)擊：

摘要：試驗(yàn)旨在探究不同堿性蛋白酶酶解對豆粕品質(zhì)的影響。在酶解條件一致（加酶 200 U/g、料水比 1∶1、溫度40 ℃、酶解時間48 h）的情況下，使用不同的堿性蛋白酶對豆粕進(jìn)行酶解。結(jié)果顯示，豆粕經(jīng)過酶解后，顏色、氣味變重，質(zhì)地水潤黏稠，pH值下降約35%，干物質(zhì)含量減少約10%，蛋白水解度增加約43%，小肽含量最少增加103%，最多增加307%，抗原蛋白幾乎全部被降解。研究表明，不同的堿性蛋白酶對豆粕品質(zhì)的改善效果不同，可以選擇適宜的堿性蛋白酶進(jìn)行降解試驗(yàn)，提高利用率。

豆粕是大豆提取豆油后的殘?jiān)偌庸さ玫降母碑a(chǎn)品，是飼料行業(yè)中使用較多的一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料源。豆粕富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成平衡。但豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子種類較多，抗?fàn)I養(yǎng)因子蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于40%，結(jié)構(gòu)緊密，不易消化。豆粕中的抗原蛋白是指會引發(fā)動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的大分子蛋白，如β-伴球蛋白（42~53、58~77、58~83 kDa）和大豆球蛋白（18~20、31~45 kDa）等，降低了畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率，在很大程度上限制了豆粕在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。近年來，隨著有關(guān)酶制劑應(yīng)用的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)體外酶解可提高其消化利用率并改善動物的生產(chǎn)性能。其中蛋白酶是蛋白質(zhì)代謝過程中重要的消化酶，能夠催化分解肽鍵，將大分子蛋白降解成小分子蛋白、小肽、氨基酸等，提高蛋白質(zhì)的利用率和飼料利用率。蛋白質(zhì)酶解是一個復(fù)雜的過程，受多種因素影響，如蛋白質(zhì)種類、酶的種類、酶解條件（料液比、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間）和酶滅活條件。蛋白質(zhì)種類和酶的種類是影響酶解產(chǎn)物組成的重要因素，不同的蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，可導(dǎo)致酶解產(chǎn)物氨基酸組成、肽的結(jié)構(gòu)和肽分子量的差別。本文使用5種不同的堿性蛋白酶對豆粕進(jìn)行酶解，探究不同堿性蛋白酶酶解對豆粕品質(zhì)的影響，從而為準(zhǔn)確使用各種堿性蛋白酶提供參考。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所使用的豆粕為市售。5種堿性蛋白酶購自多個廠家，分別命名為A、B、C、D、E。氫氧化鈉、濃硫酸、甲醛等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

CP2102電子天平、GSP9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FiveEasy Plus pH計(jì)、HJ-6A數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器、KDN-815 全自動凱氏定氮儀、Mini-PROTEAN® Tetra System 電泳儀（BIO-RAD）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將適量的豆粕放入錐形瓶中，加入堿性蛋白酶（200 U/g），按照料水比1∶1加入蒸餾水，混合物攪拌均勻，置于40 ℃培養(yǎng)箱中酶解48h。酶解結(jié)束后將酶解樣品于85 ℃烘干。

1.3.2 感官評價

參照方法，在正常光線及無任何異味的環(huán)境下，取適量豆粕酶解樣品于干凈的托盤中，通過目測評定顏色、鼻嗅評定氣味、手感評定質(zhì)地，酶解豆粕感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.3 pH值的測定

取各個豆粕酶解樣品5g，加蒸餾水50 mL，磁力攪拌 20 min，離心，測上清液pH值。

1.3.4 干物質(zhì)含量的測定

采用常壓干燥法測定干物質(zhì)含量，100 ℃干燥至反復(fù)稱量至恒重。

1.3.5 蛋白水解度的測定

采用甲醛滴定法測定蛋白水解度。此方法基于甲醛與游離氨基結(jié)合，

形成-NH-CH2OH、-N(CH2-OH)2等羥甲基衍生物，導(dǎo)致-NH3 +上的氫離子（H+）游離。堿滴定NH3 + 放出的H+ ，測出氨基氮，計(jì)算游離氨基的含量，并計(jì)算水解度（degree of hydrolysis，DH）。

DH（%）=（酶解液中氨基酸態(tài)氮含量-原料中氨基酸態(tài)氮含量）/原料中氮含量×100 （1）

1.3.6 小肽含量的測定

采用QB/HHS JC006—2013三氯乙酸法測定。

1.3.7 豆粕中抗原蛋白的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPACE）法測定豆粕中抗原蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)。

2、結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解對豆粕感官的影響（見表2）

在一定量的豆粕中加入相同酶活的不同種堿性蛋白酶，40 ℃酶解48 h后，評價各個樣品的感官特點(diǎn)。由表2可知，豆粕經(jīng)過酶解后，顏色稍深，氣味變重，質(zhì)地變水潤黏稠。其次，雖然各個豆粕樣品中添加的堿性蛋白酶不同，但是酶解后感官變化相似。

2.2 不同蛋白酶酶解對豆粕pH值的影響（見表3）

由表3可知，豆粕原料的pH值為6.51，被不同的堿性蛋白酶酶解48h后，pH值均下降，分別下降了2.23、2.32、 2.30、2.27和2.28，下降程度相似，平均下降了2.28倍。

2.3 不同蛋白酶酶解對豆粕干物質(zhì)含量的影響（見表4）

由表4可知，豆粕原料的干物質(zhì)含量為125.00 g，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h后，干物質(zhì)含量均減少，分別減少10.38、14.15、11.33、14.61 和12.96 g，減少程度相似，平均減少了0.1倍。

2.4 不同蛋白酶酶解對豆粕蛋白水解度的影響（見表5）

由表5可知，豆粕原料的水解度為2.17%，被不同的堿性蛋白酶酶解 48 h 后，水解度均增加，分別增加4.61%、4.84%、4.79%、3.87%和3.18%，增加程度相似，平均增加了0.43倍。

2.5 不同蛋白酶酶解對豆粕小肽含量的影響（見表6）

由表6可知，豆粕原料的小肽含量為4.06%，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，小肽含量均增加，分別增加307.39%、246.06%、103.45%、164.79%和126.11%。其中酶A酶解樣品后小肽最多，酶C最少。

2.6 不同蛋白酶酶解對豆粕抗原蛋白的影響（見圖1）

由圖1可知，豆粕原料中含有大量β-伴球蛋白和大豆球蛋白，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h后，抗原蛋白被大量降解，僅有加酶E的樣品中殘留少量β-伴球蛋白。

3、討論

豆粕是優(yōu)質(zhì)的飼料植物蛋白質(zhì)來源之一，存在不易消化利用等問題，需要借助酶制劑解決。本研究使用5種不同的堿性蛋白酶分別對豆粕進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果顯示，酶解結(jié)束后，各豆粕樣品的感官變化相似，說明堿性蛋白酶種類對感官變化無明顯影響。酶解結(jié)束后，樣品pH值下降，原因可能是菌體繁殖，產(chǎn)生有機(jī)酸類物質(zhì)，可以提高飼料的適口性。pH值對酶解反應(yīng)產(chǎn)生影響的因素很多。堿性蛋白酶的空間構(gòu)型在不適合的酸堿環(huán)境中會發(fā)生改變，受到可逆或者不可逆的破壞，導(dǎo)致失去酶活力，影響酶的作用。pH值的變化還會影響底物與酶的解離狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)的水解程度。但在本試驗(yàn)中，各個樣品水解度均有所增加，表明為正向影響。豆粕經(jīng)過酶解后，干物質(zhì)含量減少，小肽和蛋白水解度增加，利用蛋白酶將大分子蛋白分解成小分子物質(zhì)，如寡肽、小肽和游離氨基酸，易被腸胃道吸收，進(jìn)而提高消化利用率。豆粕中存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中抗原蛋白的危害最為嚴(yán)重，可引起仔豬發(fā)生過敏性腹瀉、腸黏膜細(xì)胞增生等一系列不良反應(yīng)，甚至造成死亡。抗原含量高低是評判豆粕品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，大部分抗原被降解，豆粕品質(zhì)得到有效提升。豆粕經(jīng)過酶解后，具有抗?fàn)I養(yǎng)因子明顯降低、常規(guī)營養(yǎng)成分得到改善、富含多種活性因子、適口性好、抗菌能力強(qiáng)等營養(yǎng)特性。

4、結(jié)論

本試驗(yàn)以豆粕原料，探究不同堿性蛋白酶酶解豆粕對其品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，除小肽含量變化差異大外，其他變化相似；酶解后樣品氣味變重，質(zhì)地水潤黏稠，pH值和干物質(zhì)含量下降，蛋白水解度和小肽含量增加，抗原蛋白幾乎全部被降解。綜上所述，酶解后的豆粕品質(zhì)得到有效改善，可選用適宜的堿性蛋白酶對豆粕進(jìn)行降解，為豆粕高值化利用提供幫助。

實(shí)戰(zhàn)操作技術(shù)——棉菜籽餅脫毒變身優(yōu)質(zhì)飼料替代豆粕操作新技術(shù)

當(dāng)前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘?jiān)?，蛋白質(zhì)含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質(zhì)，這些物質(zhì)含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現(xiàn)在通過微生物飼料發(fā)酵劑的除毒脫毒技術(shù)，可以成功將菜籽餅變?yōu)閮?yōu)質(zhì)添加飼料，直接按照1公斤發(fā)酵的棉菜籽餅（發(fā)酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進(jìn)行使用。飼料發(fā)酵劑中的有益微生物，在發(fā)酵過程中分泌的代謝產(chǎn)物，可將棉菜籽餅中的毒性物質(zhì)等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質(zhì)含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報(bào)價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點(diǎn)是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質(zhì)中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報(bào)價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質(zhì)含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質(zhì)含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質(zhì)含量36.04%。精氨酸含量高達(dá)3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報(bào)價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經(jīng)過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進(jìn)它們的營養(yǎng)吸收。只有當(dāng)其他粕類單位蛋白成本遠(yuǎn)低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經(jīng)過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產(chǎn)生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質(zhì)。這些物質(zhì)可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質(zhì)的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進(jìn)行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應(yīng)根據(jù)菜粕中有害成分含量而定。經(jīng)過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產(chǎn)的菜粕喂量要受限制。同時，應(yīng)結(jié)合菜粕的氨基酸組成特點(diǎn)，適當(dāng)搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環(huán)丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合而變成結(jié)合棉酚，結(jié)合棉酚在動物消化道內(nèi)不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導(dǎo)致生長遲緩、繁殖性能及生產(chǎn)性能下降，甚至導(dǎo)致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據(jù)飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優(yōu)質(zhì)粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經(jīng)過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應(yīng)注意添加賴氨酸。

發(fā)酵操作技術(shù)

發(fā)酵棉菜籽餅其實(shí)也是一個脫毒技術(shù)，具體操作如下：

1.仔細(xì)檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴(yán)重變質(zhì)發(fā)霉的部分，輕度發(fā)霉的原料可以忽略，因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調(diào)節(jié)飼料營養(yǎng)比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發(fā)酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復(fù)合酶制劑的專業(yè)發(fā)酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發(fā)酵方式根據(jù)實(shí)際環(huán)境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發(fā)酵均可。

6.發(fā)酵時要盡可能排盡空氣進(jìn)行密封發(fā)酵。如果使用的發(fā)酵容器有密封不嚴(yán)實(shí)的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發(fā)酵過程中不能啟封。

7.發(fā)酵時間受環(huán)境溫度影響，通常夏季發(fā)酵2-3天，冬季發(fā)酵5-7天即可完成。發(fā)酵完成后，有較為強(qiáng)烈的酸香味，ph值在3-4。

規(guī)模運(yùn)用混合發(fā)酵現(xiàn)場

塑料缸、飼料袋（有內(nèi)膜）均可做發(fā)酵飼料

采用池子發(fā)酵

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動物技術(shù)

需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長時間保存（一年左右）。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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