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隨著我國飼料資源的日趨緊張及抗生素的禁用，積極尋找健康多元化的飼料資源及安全高效的飼料生產模式，成為了畜牧工作者亟待解決的首要任務。發酵飼料作為一種新型、綠色的環境友好型飼料，制作過程中有益微生物大量繁殖，可將飼料中蛋白質分解為氨基酸及小分子的肽，淀粉分解發生糖化、酸化，兼備微生態制劑、酶及糖化處理的功能。然而，發酵飼料在畜禽上應用的研究結果并非十分一致。大多研究表明，發酵飼料對畜禽日增重、飼料轉化效率、免疫功能及腸道健康等方面均體現出一定的促進作用。另有結果顯示，飼料中蛋白質經發酵脫羧產生生物胺，其過度積累將導致飼料適口性降低及氨基酸的不可逆損失。發酵飼料制作工藝的不同，是其飼用效果呈現多樣性的重要原因，亦是其功能性評價成敗的關鍵。因此，本試驗采用固體發酵工藝制備固態發酵醋糟飼料(solid-state fermentation vinegar dregs，SFVD)，并研究其對育肥豬生長性能、養分表觀消化率、血清指標及糞便中揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)含量的影響，以期為新型生物飼料的研發與應用提供數據參考。

1  材料與方法

1.1  試驗材料

發酵菌種:布拉式酵母菌(Saccharomyces bou lardji)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)均由北京龍科方舟生物工程技術有限公司提供。

胰蛋白胨、酵母提取物購于英國 Oxoid 公司，氯化鈉(NaCl)、葡萄糖購于國藥集團化學試劑有限公司，乳酸細菌培養基(MＲS 培養基)購于北京奧博星生物技術有限公司。溶菌肉湯培養基(LB培養基)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD培養基)組成見表 1。

1.2  試驗設計與飼養管理

選擇體況相近［(59.04±0.33)］kg 的健康“杜 × 長 × 大”三元雜交育肥豬 60 頭，隨機分為 2 個組，每組 3 個重復，每個重復 10 頭豬，各重復間初始體重差異不顯著(P ＞ 0.05)。基礎飼糧參考NＲC(2012)營養需要配制，基礎飼糧組成及營養水平見表 2.對照組飼喂基礎飼糧 +150 mg /kg 土霉素鈣，試驗組飼喂基礎飼糧 +5%的 SFVD。自由采食和飲水，預試期 6 d，正試期 35 d。

試驗開始前對豬舍進行全面清掃、消毒，試驗期間每周進行 1 次豬舍消毒。豬舍內環境溫度維持在 20～25 ℃，相對濕度為 65%。豬只管理和免疫按常規進行。動物試驗于 2018 年 12 月 6 日至2019 年 1 月 10 日在重慶市畜牧科學院動物營養研究所進行。

1.3  SFVD 的配制

據課題組前期研究結果，試驗對 SFVD 制備工藝進一步優化:植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌及布拉式酵母菌液分別接種于液體 MＲS(37 ℃靜置培養 16 h)、LB(37 ℃、220 r/min 培養 16 h)和 YPD培養基(30 ℃、200 r/min 培養 24 h)培養后，分別以 1%接種量接種于發酵罐中，控制罐壓、通氣量、溶氧、pH 及溫度等條件。裝袋密封，室溫厭氧發酵 5 d。飼料需于開袋后 15 d 內使用完畢，隨用隨取，隨取隨封，嚴防二次發酵及霉菌污染。發酵菌種的培養均采用先搖瓶、后發酵罐的擴繁模式。發酵罐容積 50 L，植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌培養基添加量為 35 L /罐，布拉式酵母菌培養基添加量為 30 L /罐。布拉式酵母菌培養過程中，當溶氧解含 量 開 始 回 升 時，補料5 L，流 速 控 制 為30 mL /(h•L)。菌種的培養工藝詳見表 3，生物飼料組成及營養水平見表 4。

1.4  樣品采集與指標測定

1.4.1  生長性能測定

每天記錄仔豬采食量，試驗前后對仔豬進行稱重，并根據以上數據計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2  常規養分含量的測定

糞樣、飼料樣中的干物質( DM ) 含量采用105 ℃烘干法(GB /T 6435—2006)測定，粗蛋白質(CP)含量采用凱氏半微量定氮法(GB /T 6432—1994)測定，粗脂肪(EE)含量采用索氏乙醚提取法(GB /T 6433—2006)測定，粗灰分(Ash)含量采用 550 ℃ 灰化法(GB /T 6438—2007) 測定，粗纖維( CF) 含 量 參 照 GB /T 6434—2006/ISO 68652000 的方法測定;鉻含量參照 GB /T 13088—2006的方法，經濕法消解(硝酸加高氯酸)處理后，使用原子吸收光譜儀(日立 －Z－5000，日立集團，日本)測定。

1.4.3  養分表觀消化率的測定

在正試期第 30 ～ 35 天的飼糧中添加 0.3%的三氧化二鉻(Cr 2O 3)作為外源指示劑，測定養分表觀消化率。3 d 預試期后，于試驗期第 33～35 天，每天從每個重復中選取有代表性的糞樣約 200 g，－20 ℃保存。將 3 d 的糞樣混合均勻，一部分用于VFA 含量的測定;一部分置于 65 ℃ 烘箱中 72 h，回潮 24 h 后，粉碎樣品過 40 目，按照四分法取樣500 g，－4 ℃保存待測。

養分表觀消化率(%)= 100－［(飼糧中鉻含量 × 糞中某養分含量) /(糞中鉻含量 ×飼糧中某養分含量)］×100。

1.4.4  血樣的采集、處理與測定

于正試期第 35 天晨飼前，每個重復選擇 3 頭豬，空腹經前腔靜脈采血 15 mL 于真空促凝采血管中，傾 斜 靜 止 30 min 后，4 000 r/min 離 心10 min，分離血清，－20 ℃ 保存，用于血清生化、抗氧化及免疫指標的測定。

谷 草 轉 氨 酶 ( aspartate aminotransferase，AST)、谷 丙 轉 氨 酶 ( alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 活性及總蛋白(total protein，TP)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、尿素氮(urea nitrogen，UN)含量使用 COBUS MIＲA Plus 自動生化分析儀測定。

化學比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，酶聯免疫吸附法測定免疫球蛋白 A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白 G(immunoglobulinG，IgG)含量，所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所，并嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5  數據處理

試驗數據采用 SAS 9.2 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異性及趨勢性判定標準分別為 P＜0.05 和 0.05≤P＜0.10。

2  結果與分析

2.1 SFVD  對育肥豬生長性能的影響

由表 5 可見，與對照組相比，基礎飼糧中添加5%的 SFVD 對育肥豬 ADFI 具有一定的促進趨勢(P=0.056)，對 ADG 和 F/G 均沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.2  SFVD 對育肥豬養分表觀消化率的影響

由表 6 可見，與對照組相比，基礎飼糧中添加5%的 SFVD 顯著降低了育肥豬飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 表觀消化率(P＜0.05)，對 EE 表觀消化率有一定的促進趨勢(P= 0.052)，對 CF 表觀消化率沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.3  SFVD 對育肥豬血清生化指標的影響

由表 7 可見，與對照組相比，基礎飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性(P＜0.05)，血清AST /ALT 和HDL 含量也呈現出一定的升高趨勢(P = 0.082 和 P= 0.055)，對血清ALT、ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.4  SFVD 對育肥豬血清抗氧化和免疫指標的影響

由表 8 可見，與對照組相比，基礎飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性(P＜0.05)，對血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均沒有顯著影響(P＞0.05);血清 IgA 含量呈現出一定的升高趨勢(P = 0.077)，而對血清 IgG 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.5  SFVD 對育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

3  討 論

3.1  SFVD 對 育 肥 豬 生 長 性 能 和 養 分 表 觀消化率的影響

飼料經發酵處理后，可將飼料中的大分子有機物降解為更容易被機體利用的小分子物質，同時產生大量菌體蛋白及多種代謝產物。其中，乳酸及多種 VFA 的存在使其具備酸香味，從而改善飼料適口性，邏輯上利于動物生長性能的提高。然而，發酵飼料對動物生長性能及養分消化率方面的研究結論卻并不十分一致。

眾多研究表明，發酵飼料對育肥豬、肉雞、肉兔、朗德鵝、羔羊及肉牛的生長性能及表觀消化率均表現出良好的促進作用。周映華等采用復合菌種(乳酸菌∶釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌 =1∶1∶1)對育肥豬全價飼料進行發酵，結果顯示，發酵飼料與基礎飼糧 1∶4 混合使用，能夠顯著提高育肥豬的 ADG 和 ADFI，降低F/G，同時顯著提高飼糧中 CP 和 CF 的表觀消化率，這與 Hu 等的研究結果吻合。本試驗結果發現，基礎飼糧中添加 5%的 SFVD 使飼糧適口性得到改善，進而提高了育肥豬的 ADFI，這與前期眾多報 道 一 致。此 外，基 礎 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 對育肥豬的 ADG 和 F/G 均沒有造成顯著影響，可能與飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 的表觀消化率降低有關。研究表明，飼糧中 CF 水平每提高1%，反芻動物 OM 的消化率降低 0.65% ～0.70%，單胃動物降低 1.35% ～1.40%，且不同纖維源對營養物質消化率的影響不同。本試驗以醋糟和小麥麩為纖維源制作的 SFVD(CF 含量 16.4%)，基礎飼糧中添加 5%的 SFVD 使育肥豬飼糧 CF 表觀消化率提高了 0. 61%，OM 表觀消化率降低了1.69%，這可能與所選纖維源不可溶非淀粉多糖(insoluble non-starch polysaccharide，INSP)含量較高有關。飼糧中可溶性非淀粉多糖(soluble non-starch polysaccharide，SNSP)含量過高可造成食糜的營養屏障效應，而 INSP 含量過高使食糜流通速度加快，是導致營養物質消化率降低的重要原因。因此，不同制備工藝的生物飼料對育肥豬生長性能及養分表觀消化率的影響不同，而有關纖維組分與養分表觀消化率間的相關性及其作用機理的研究，尚需進一步證實。

3.2  SFVD 對育肥豬血清生化指標的影響

血清生化指標是反映機體代謝及各組織器官功能的間接體現。正常生理狀態下，ALT 和 AST分別主要存在于胞質和線粒體中，尤以肝臟和心肌細胞中活性最高。當細胞受損時，胞膜通透性改變，大量的 ALT 和 AST 涌入血液，致使血液中ALT 和 AST 活性升高。因此，ALT 和 AST 常被用作肝臟及心肌疾患檢測的敏感指標。本試驗條件下，基礎飼糧中添加 5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性，提示可能對心肌細胞產生了負面影響，但由于 2 組血清 AST 活性均處于較低水平，臨床學意義不大，故在此不做冗余討論。此外，在血清 AST 和 ALT 活性均未出現顯著異常的前提下，AST /ALT 的上升并不足以斷定本研究過程中出現了肝損傷。

研究表明，飼喂發酵飼料能夠提高豬血清 TP和 UN 含量，促進機體蛋白質的整體代謝，同時對血清 ALP 活性具有顯著的促進作用，提示發酵飼料的使用對豬的生長發育具有潛在的促進作用。而本研究發現，基礎飼糧中添加 5%的 SFVD并未對育肥豬血清 TP、UN 含量及 ALP 活性造成顯著影響，這可能與發酵飼料的原料、工藝及使用量密切相關。值得一提的是，試驗組血清中 HDL含量呈現出高于對照組的趨勢，提示 SFVD 對育肥豬血脂代謝可能具有潛在促進作用，推測原因可能與 VFA 的大量產生有關，本研究結果與前人報道基本一致。此外，本試驗條件下，2 組間血清 ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量均未表現出統計學差異。

3.3  SFVD 對育肥豬血清抗氧化和免疫指標的影響

發酵飼料中含有豐富的微生物，可作為獨立抗原，在刺激機體免疫系統和提高氧化應激能力等方面具有重要的作用。徐秀景等試驗表明，采用乳酸菌發酵飼料飼喂生長育肥豬，能夠提高血清中 GHS-Px 等抗氧化物酶活性，增強機體抗氧化能力。本試驗條件下，基礎飼糧中添加 5%的SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性，而對血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均未造成顯著影響。本試驗采用的 SFVD 含有豐富的植物乳桿菌(2.7×10 7 CFU /g)等益生菌，可通過與金屬離子螯合，降低羥自由基前體的含量，也能產生 GSH-Px、阿魏酸酯酶(FAE)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶，阻止高活性氧的形成，從而提高機體抗氧化能力。

此外，有研究表明，采用無抗生素發酵飼料飼喂斷奶仔豬，可以通過增加小腸上皮間淋巴細胞、M 細胞和 CD3 + T 細胞數量，進而提高小腸的黏膜免疫 。本研究發現，試驗組血清 IgA 含量呈現出一定升高趨勢，提示 SFVD 也可能對育肥豬的黏膜免疫具有潛在的促進作用，這與 Ahmed 等的研究結果一致。盡管研究者對發酵飼料提高機體免疫功能的觀點普遍認可，但其微生物與機體免疫間可能存在的對話機制仍有待畜牧工作者進一步探索。

3.4  SFVD 對育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

腸道中微生物發酵產生的 VFA 主要以乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)為主。報道顯示，VFA 與腸上皮細胞的代謝、增殖分化、肝臟的脂質代謝等密切相關。值得強調的是，腸道中 VFA 總量的 95%可被吸收代謝，最高可提供宿主所需能量的9% 。本 研 究 顯 示，基 礎 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 顯著提高了育肥豬糞便中丙酸含量，糞便中甲酸和 TVFA 含量也呈現出一定的升高趨勢，而對糞便中乳酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量沒有顯著影響。推測可能與飼糧結構的改變有關，一方面，試驗組相對較高的纖維水平，為動物后腸道產 VFA 菌群提供了良好的培養基質;另一方面也可能與 SFVD 自身含有的高活菌數及VFA 有關，提示本工藝條件下的 SFVD 對腸道健康具有潛在的促進作用。

眾多學者認為，VFA 可通過降低腸道 pH 來抵御感染及致病菌的侵襲。研究表明，飼喂發酵飼料可降低不同腸段腸桿菌科和沙門氏菌數量，提高乳酸桿菌數量，推測原因為發酵飼料使腸道中乳酸及 VFA 含量增加，導致 pH下降所致。菌體細胞內酸解離導致 pH 下降，從而致使酶和質子動力泵坍塌，輔以陰離子自身的殺傷效應，達到破壞菌體的效果。誠然，pH對腸道微生物區系的穩定至關重要，而另有學者認為，解離的乳酸和 VFA 不能自由穿越菌體膜，因而腸桿菌科和沙門氏菌數量的減少只與未解離的部分有關。盡管 VFA 對腸道健康的正面效應已被眾多研究者普遍認可，但飼糧 － 菌群 －VFA軸的相關性尚不十分明確。有關飼糧對宿主腸道微生物的調控機制研究，將是本課題組接下來的重要探究內容之一。

4  結 論

基礎飼糧中添加 5%的本工藝條件下制備的SFVD 對育肥豬生長性能、腸道健康及免疫性能的提高具有潛在的促進作用。

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