1.3 料水比對小肽含量的影響

料水比是影響固體發酵的重要因素之一。水分含量影響發酵過程中微生物的生長。同時對酶的作用影響也比較大。由圖3的結果可知，小肽的含量隨著料水比的增加，呈現先增大后減小的趨勢，當料水比為1：1.2時，小肽含量最高，為194.90mg／g。當料水比過大時，小肽含量呈現減少的趨勢，可能是由于芽孢桿菌這類好氧菌在水分過多時生長受到抑制，從而影響了蛋白質降解成小肽。

1.4 發酵溫度對小肽含量的影響

溫度是影響酶活的重要因素，酶活的高低，直接影響到豆粕中蛋白質酶解成小肽。由圖4的結果可知，小肽含量隨溫度的升高，先增加后減少，當發酵溫度為40℃時，小肽含量最高，為192.73mg/g。

1.5 發酵時間對小肽含量的影響

由圖5的結果可知：隨著發酵時間的延長，小肽的含量先上升后略有下降，當發酵時間為48h時，小肽含量最高為182.43mg／g。當發酵時間長于48h，隨著酶解時間的延長，小肽被進一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現下降趨勢，因此酶解時間不宜過長。

2 豆粕菌酶混合發酵工藝優化

在單因素試驗的基礎上，得到各因素的適宜水平后，設計5因素4水平L16(45)的正交試驗進行發酵工藝優化，試驗因素水平編碼表、試驗設計及實施方案和結果見表1、表2。

2.1 正交試驗結果的直觀分析

從表2直觀分析可以看出，極差列中接種量因素的極差值最大，所以得出結論接種量因素對小肽含量的影響最大，其次是發酵溫度、料水比、發酵時間、發加酶量。發酵最優條件為A1B3C2D4E3，即接種量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，溫度40℃，時間60h。

2.2 發酵方案的確定

從正交表中觀察得知最優組合為A1B3C3D3E3，與理論最優條件A1B3C2D4E3對比可知發酵時間不同，結合單因素試驗結果，發酵時間過長小肽含量反而有所下降，因此對這兩種方案進行3次驗證試驗，測得小肽含量與粗蛋白質含量見表3。

由表3可知，理論最優條件沒有正交表中最優組合結果好，因此最優條件為A1B3C3D3E3，即接種量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，溫度40℃，時間48h，發酵結束后小肽含量從11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白質從47.62％提高到56.72％。

2.3 SDS—PAGE電泳檢測蛋白降解程度

將最終確定的發酵工藝的發酵產品進行SDS—PAGE檢測，以原料豆粕做對照，結果見圖6。圖6結果顯示，與原豆粕相比，發酵產品中的大分子蛋白得到有效降解，生成小分子的多肽、小肽和氨基酸，其蛋白質的分子質量在45kDa以下，小于14.4kDa的占很大一部份，由此可見，發酵后豆粕的品質得到了有效提升。

討論

小肽的制備主要采用微生物發酵法和酶解法。從本質上講，微生物發酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用。微生物發酵法生產小肽的工藝主要有固體發酵和液體發酵。微生物固體發酵的優點是能較好地去除豆粕中的抗營養因子。發酵過程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等，其本身就是益生菌，有利于改善動物胃腸道的微生態環境，減少抗生素的應用和疾病的發生。本研究采用的是芽孢桿菌和酵母菌混合發酵豆粕，芽孢桿菌相對于霉菌來講，生長速度較快，發酵周期較短，降低了生產成本，并且在發酵過程中分泌蛋白酶，利用蛋白酶的內切作用將蛋白質降解成低分子質量的肽，因此對豆粕蛋白有較好的降解作用；酵母菌在發酵過程中產生酒香味，使發酵產品的風味有所提升，同時酵母本身也是很好的菌體蛋白，使豆粕發酵后的粗蛋白質提高。

目前酶解法制備小肽。主要采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶(劉通訊，2002)。萬琦(2003)，劉大川和鐘方旭(1996)研究了5種蛋白酶：中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性，篩選出堿性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽，水解效果雖然較好，但是產物帶有強烈的苦味，需要采取一定的脫苦工藝后方可使用。王之盛和況應谷(2004)的研究結果表明，在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解，中堿性條件有利于7S和2S小分子質量抗原蛋白的進一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕，相對于堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，避免固體發酵pH調節困難的問題，使發酵方式更為簡單有效。

菌酶混合協同處理法生產小肽，充分利用微生物發酵與酶解各自的優勢。發揮微生物與蛋白酶的協同作用使豆粕蛋白降解更充分，小肽化程度更高，同時避免了酶解產品的苦味，提高產品風味及適口性，進一步改善了豆粕飼用肽產品品質和營養價值。這對實現飼用肽的工業化生產具有重要的參考價值。

結論

以豆粕為原料，利用芽孢桿菌、酵母菌、中性蛋白酶混合發酵豆粕生產小肽飼料。在接種量1.5％、加酶量450U/g、料水比1：1.4、發酵溫度40℃、發酵時間48h條件下。豆粕發酵后，小肽含量和粗蛋白含質量都有顯著提高，小肽含量從11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白質從47.62提高到56.72％。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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2020年已全面禁抗，我們之前經常在飼料中添加的抗生素進行促生長行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進動物生長又能夠形成無抗養殖呢？其實中草藥在促進畜禽養殖健康和生長、改善肉蛋奶品質大有可為，特別是將中草藥發酵后效果提升4-28倍等好處，這個實施方案比你想象中效果更好，運用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗證

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