發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)育肥豬結(jié)腸微生物發(fā)酵及菌群組成的影響
生長(zhǎng)育肥豬的健康狀況直接影響到豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。為改善豬體健康，傳統(tǒng)方法是在飼料中添加飼用抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的，但隨著人們對(duì)飼用抗生素帶來(lái)的藥物殘留及生態(tài)安全等問(wèn)題的認(rèn)識(shí)的不斷深入，飼料中禁用飼用抗生素已是大勢(shì)所趨；發(fā)酵飼料作為一種綠色、環(huán)保的新型健康飼料，一定程度上可以減少飼用抗生素的使用，降低養(yǎng)殖成本，因而受到養(yǎng)殖界的廣泛關(guān)注。
豬后腸具有復(fù)雜的微生物菌群，這些微生物在維持動(dòng)物機(jī)體健康、改善機(jī)體代謝及維持腸道穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用。研究表明，使用發(fā)酵飼料可以減少腸道致病菌的定植，改善腸道健康，然而，目前仍不清楚使用發(fā)酵飼料對(duì)豬腸道菌群組成的具體影響，為闡明這一問(wèn)題，本試驗(yàn)以復(fù)合菌發(fā)酵飼料飼喂生長(zhǎng)育肥豬，利用高通量測(cè)序手段研究了育肥豬結(jié)腸黏膜及其內(nèi)容物中細(xì)菌菌群組成的變化，擬為生物發(fā)酵飼料在育肥豬中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)日糧與試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)于2017年4月–2017年5月進(jìn)行，選用健康、日齡基本一致、體重約60 kg的杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬24頭，隨機(jī)分為2組，分別為基礎(chǔ)日糧組(對(duì)照組)、復(fù)合菌發(fā)酵飼料組(試驗(yàn)組)，每組4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)3頭豬。日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。
復(fù)合菌發(fā)酵飼料的制作程序如下：采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物實(shí)驗(yàn)室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液，并按質(zhì)量比2：2：1進(jìn)行混合（復(fù)合菌的總數(shù)量約為1×109 CFU/g），取對(duì)照組基礎(chǔ)日糧，按2 g/kg復(fù)合菌液添加于日糧中，調(diào)節(jié)飼料濕度為40%，混合均勻后分裝至單通閥發(fā)酵袋中，于37 °C發(fā)酵2天，飼喂前再與基礎(chǔ)日糧以1：4的比例混合，將混合飼料作為試驗(yàn)組日糧。試驗(yàn)期間，每日飼喂2次，自由采食，自動(dòng)飲水。試驗(yàn)期為30 d。
1.2 樣品采集與制備
于試驗(yàn)正式開始后第30 天，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇一頭豬屠宰，屠宰后迅速取出整個(gè)消化道，分腸段進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)腸全部?jī)?nèi)容物迅速混勻后，測(cè)定內(nèi)容物pH值，另取部分內(nèi)容物按1：1的質(zhì)量比與去離子水混合，5000 g下離心10 min后，一部分上清液凍存于-20 °C冰箱中用于乳酸濃度的測(cè)定，另一部分上清液中以5：1的比例加入25%（W/V）偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于-20 °C冰箱中用于揮發(fā)性脂肪酸濃度的測(cè)定；取部分樣品于-20 °C保存，用于細(xì)菌DNA提取；無(wú)菌剪刀剪取結(jié)腸中段，無(wú)菌冰磷酸緩沖液清洗干凈，采用無(wú)菌載玻片將黏膜和肌肉層分離開，刮取黏膜，樣品于-80 °C保存?zhèn)溆谩?/span>
1.3 結(jié)腸內(nèi)容物中pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定
采用固體pH計(jì)(HANNA，美國(guó))測(cè)定結(jié)腸內(nèi)容物pH，乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸測(cè)試盒測(cè)定。樣品解凍后，12000 g離心5 min，取0.3 μL上清液于GC-14B型氣相色譜儀(Shimadzu，日本)測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸濃度。
1.4 結(jié)腸黏膜和內(nèi)容物中DNA提取及MiSeq測(cè)序
選用美國(guó)MoBio公司PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒對(duì)結(jié)腸黏膜樣本的基因組DNA進(jìn)行提取；采用CTAB法提取結(jié)腸內(nèi)容物中DNA，取0.3 g解凍的結(jié)腸內(nèi)容物，加入2 mL磷酸緩沖液后渦旋混勻、12000′g離心，類似操作，清洗樣品2–3次。在所得沉淀中加入1 mL CTAB溶液，混勻后轉(zhuǎn)移至含有0.3 g滅菌鋯珠的鋯珠管中，采用珠磨儀(Biospec，美國(guó))破碎細(xì)胞，再采用酚-氯仿-異戊醇提取結(jié)腸內(nèi)容物中細(xì)菌總DNA。采用NanoDrop ND-2000 spectrophotometer (Thermo fisher，美國(guó))測(cè)取DNA濃度。在Illumina (MiSeq)平臺(tái)進(jìn)行DNA雙端測(cè)序。使用細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為515F (5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3)和806R (5′-GGACTACCVGGGTATCTAAT-3′)。擴(kuò)增條件為：95 °C 2 min；95 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min。
1.5 生物信息學(xué)分析
根據(jù)Barcode的信息，將單個(gè)樣品數(shù)據(jù)拆分出來(lái)，刪除引物序列，進(jìn)行測(cè)序序列質(zhì)量控制，將不含樣品信息的序列、過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)的序列、出現(xiàn)ambiguous堿基及含有過(guò)多homologous堿基的序列去除；通過(guò)質(zhì)量檢查的優(yōu)質(zhì)序列，應(yīng)用QIIME (v.1.8.0)軟件進(jìn)行分析處理，應(yīng)用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3進(jìn)行分類，使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(v.1.1.9)進(jìn)行序列比對(duì)(alignment)，確定每條序列的分類等級(jí)。OTUs (operational taxonomic units，分類操作單元)劃分以序列相似性97%為標(biāo)準(zhǔn)。
1.6 多樣性分析
通過(guò)豐富度指數(shù)(Chao、Ace)、多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)對(duì)樣品中物種Alpha多樣性進(jìn)行分析；采用隨機(jī)抽樣的方法抽取OTU數(shù)據(jù)，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)目構(gòu)建曲線，即得稀疏曲線；基于OTU相對(duì)豐度對(duì)結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物樣本中菌落組成進(jìn)行門水平、屬水平分析。
1.7 統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel (2010)初步處理后，常規(guī)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，高通量測(cè)序結(jié)果采用Kruskal-Wallis進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平(P值)置于0.05。
2生物發(fā)酵飼料的作用機(jī)理
2.1 結(jié)腸內(nèi)容物中發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定
表2為育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中pH、乳酸及VFA濃度的測(cè)定，與對(duì)照組比較，采食20%復(fù)合菌發(fā)酵飼料的豬結(jié)腸內(nèi)容物中僅丁酸水平顯著升高(P<0.05)，而兩組間在pH、乳酸、乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量方面無(wú)顯著差異(P>0.05)。
2.2 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物OTU水平分析
由圖1 可見(jiàn)，結(jié)腸黏膜(A)及內(nèi)容物(B)的稀疏曲線顯示，隨著測(cè)序深度增加，曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。
2.3 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物細(xì)菌群落的多樣性分析
由表3可見(jiàn)，飼喂含發(fā)酵飼料的日糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細(xì)菌的OTU數(shù)量、ACE及Chao等特種豐度和多樣性指數(shù)并沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。由圖2可見(jiàn)，PCA圖顯示，對(duì)照組與處理組兩組間均可明顯區(qū)分開，說(shuō)明兩組菌群之間存在差異性。進(jìn)一步AMOVA分析，顯示飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料顯著影響了育肥豬結(jié)腸黏膜(Fs=2.19，P=0.025)和內(nèi)容物(Fs=1.92，P=0.026)的細(xì)菌群落。
2.4 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物細(xì)菌類群分析
Venn圖可反映樣本間及組間共有和特有的OTU數(shù)目，從而直觀地反映出樣本間及組間細(xì)菌菌群組成的重疊情況。圖3-A中可以看出結(jié)腸黏膜中共有的細(xì)菌OTU數(shù)目為411個(gè)，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等。其中，對(duì)照組獨(dú)有的細(xì)菌OTU分別屬于金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發(fā)酵飼料組獨(dú)有的細(xì)菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)、綠膿桿菌屬(Pseudomonas)。
從圖3-B中可以看出，結(jié)腸內(nèi)容物中共有的OTU數(shù)目為405個(gè)，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)等。其中，對(duì)照組育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中獨(dú)有的細(xì)菌OTU分別屬于黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、擬桿菌目(Bacteroidales)、密螺旋體屬(Treponema)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發(fā)酵飼料組獨(dú)有的細(xì)菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、擬桿菌目(Bacteroidales)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)。
2.5 結(jié)腸細(xì)菌門水平分析
由圖4可見(jiàn)，育肥豬結(jié)腸黏膜細(xì)菌菌群中有16 個(gè)菌門，其中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(46.13%)、變形菌門(31.55%)、擬桿菌門(10.94%)，在門豐度上，兩組之間未有顯著變化；在內(nèi)容物中的細(xì)菌菌群共檢測(cè)到15個(gè)菌門，其中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(52.32%)、變形菌門(37.52%)、擬桿菌門(3.25%)。與對(duì)照組比較，飼喂發(fā)酵飼料組的育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中螺旋體菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，但對(duì)其他菌門的豐度無(wú)顯著影響(P>0.05)。
2.6 結(jié)腸細(xì)菌屬水平分析
育肥豬結(jié)腸黏膜(圖5-A)及內(nèi)容物(圖5-B)中細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度如圖所示，育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中共檢測(cè)到116個(gè)菌屬，以相對(duì)豐度0.5%為標(biāo)準(zhǔn)篩選出35個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，與對(duì)照組比較，發(fā)酵飼料組未分類菌屬、Subdoligranulum菌屬、脫硫弧菌屬和魏斯菌屬的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。黏膜中共檢測(cè)到116個(gè)菌屬，以相對(duì)豐度0.5%為標(biāo)準(zhǔn)篩選出34個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，與對(duì)照組比較，發(fā)酵飼料組中的未分類菌屬、柔嫩梭菌屬和魏斯菌屬的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。
2.7 結(jié)腸細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)
利用PICRUSt作為一種預(yù)測(cè)工具對(duì)結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，在所有樣品中，總共發(fā)現(xiàn)39個(gè)基因家族；通過(guò)對(duì)KEGG通路的PCA分析，顯示無(wú)論結(jié)腸黏膜還是內(nèi)容物，兩組樣品之間未區(qū)分開，表明兩組之間的功能存在一定的相似性(圖6)。這些基因家族中，大部分基因與膜轉(zhuǎn)運(yùn)(對(duì)照組在黏膜中為11.92%，內(nèi)容物中為11.62%；試驗(yàn)組分別為11.72%，11.78%)、碳水化合物代謝(對(duì)照組在黏膜和內(nèi)容物中分別為9.80%，10.13%；試驗(yàn)組分別為9.85%，10.13%)、氨基酸代謝(對(duì)照組在黏膜和內(nèi)容物中分別為9.61%，9.72%；試驗(yàn)組分別為9.63%，9.68%)相關(guān)。在所有基因家族中，結(jié)腸黏膜細(xì)菌中，涉及免疫系統(tǒng)(P=0.021)和翻譯(P=0.021)的基因家族的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，而有關(guān)復(fù)制和修復(fù)(P=0.043)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(P=0.04)的基因家族相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組；在結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌菌群中，飼喂發(fā)酵飼料組的細(xì)菌菌群中有關(guān)遺傳信息處理(P=0.021)的基因家族相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，而有關(guān)免疫系統(tǒng)疾病(P=0.021)和神經(jīng)系統(tǒng)(P=0.043)的基因家族相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。
3討 論
消化道微生態(tài)是豬機(jī)體最為重要和復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一，其中菌群的數(shù)量及種類可隨著機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育而不斷發(fā)生變化，維持一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)平衡，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，豬消化道微生態(tài)與宿主形成了互利共生的關(guān)系。豬微生物消化的主要場(chǎng)所位于消化道后段，胃和小腸未吸收的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)入后腸，經(jīng)微生物進(jìn)一步發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物可被吸收，進(jìn)入機(jī)體起到供能及調(diào)控宿主代謝與免疫的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂含發(fā)酵飼料的日糧的豬結(jié)腸中丁酸含量顯著升高，由于丁酸是動(dòng)物體內(nèi)腸上皮細(xì)胞組織再生和修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其還可抑制腸道內(nèi)的病原菌或腐敗菌生長(zhǎng)，促進(jìn)益生菌的發(fā)育和增殖；此外，已有研究表明，丁酸還可通過(guò)多種途徑影響結(jié)腸屏障功能，改善結(jié)腸上皮細(xì)胞防御功能，緩解腸炎。因此，發(fā)酵飼料組豬結(jié)腸中丁酸含量升高，說(shuō)明飼喂發(fā)酵飼料有利于豬后腸道健康。
本試驗(yàn)在育肥豬結(jié)腸黏膜中檢測(cè)到16個(gè)菌門和116個(gè)菌屬，內(nèi)容物中共檢測(cè)到15個(gè)菌門和116個(gè)菌屬。在門水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中相對(duì)豐度最高的兩個(gè)細(xì)菌門類，目前關(guān)于這類細(xì)菌的主要生理功能的研究顯示，這兩個(gè)菌門主要參與日糧中多糖物質(zhì)和蛋白質(zhì)降解。同時(shí)，有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道細(xì)菌中主要的菌門，因此，在豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中，厚壁菌門和擬桿菌門在結(jié)腸微生物發(fā)酵及微生態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌是厚壁菌門的主要成員之一，前人研究表明，該類細(xì)菌菌群可利用底物中的纖維素發(fā)酵產(chǎn)生包含丁酸在內(nèi)的多種揮發(fā)性脂肪酸，Subdoligranulum菌屬是柔嫩梭菌屬的一個(gè)亞屬，其特性與柔嫩梭菌屬相似。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組育肥豬結(jié)腸黏膜中柔嫩梭菌屬和內(nèi)容物中Subdoligranulum菌屬相對(duì)豐度顯著升高，由于柔嫩梭菌屬和Subdoligranulum菌屬為丁酸產(chǎn)生菌，其相對(duì)豐度升高會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸中丁酸水平上升，該結(jié)果也與發(fā)酵飼料組結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸水平顯著升高相印證。
豬腸道黏膜菌群是一類主要定植在豬腸道黏膜上的微生物，這類微生物菌群可形成生物膜，起到微生物屏障作用。有研究顯示，宿主腸道內(nèi)微生物屏障可阻礙病原菌在腸壁上的定植，并可促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能。而一旦腸道菌群與宿主間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，致病菌可大量增殖，就有可能導(dǎo)致各類疾病的發(fā)生。魏斯菌屬是乳酸菌的一種，有研究表明，魏斯菌屬對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌有抑制作用，魏斯菌屬可產(chǎn)生一種葡聚糖，促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中魏斯菌屬的相對(duì)豐度顯著升高，該結(jié)果說(shuō)明，日糧中添加發(fā)酵飼料有利于改善豬結(jié)腸的菌群結(jié)構(gòu)。同時(shí)，本研究在發(fā)酵飼料組豬結(jié)腸中檢測(cè)到大量有益菌如葡糖桿菌和醋酸桿菌，而一些在對(duì)照組豬結(jié)腸中檢測(cè)到的致病菌如密螺旋體屬、產(chǎn)吲哚金黃桿菌等并未在發(fā)酵飼料豬結(jié)腸黏膜上檢測(cè)到；這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料可增加育肥豬結(jié)腸黏膜上有益菌數(shù)量，抑制有害菌增殖。
相關(guān)研究表明，腸道細(xì)菌對(duì)維持機(jī)體代謝與健康起著重要作用，本試驗(yàn)應(yīng)用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)了育肥豬結(jié)腸黏膜和內(nèi)容物上附著細(xì)菌的潛在功能。結(jié)果顯示，飼喂發(fā)酵飼料組的育肥豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細(xì)菌菌群的潛在功能與對(duì)照組之間皆存在顯著差異，說(shuō)明細(xì)菌群落的改變可能會(huì)導(dǎo)致其功能的改變。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組育肥豬結(jié)腸有關(guān)免疫系統(tǒng)的細(xì)菌基因豐度增多，而有關(guān)免疫系統(tǒng)疾病的細(xì)菌基因比例減少，結(jié)果說(shuō)明，飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料可改善育肥豬后腸健康；此外，試驗(yàn)組育肥豬結(jié)腸中有關(guān)遺傳信息處理及翻譯的細(xì)菌基因的百分比升高，這說(shuō)明飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料后，腸道細(xì)菌可能對(duì)自身遺傳信息的表達(dá)能力增強(qiáng)，從而增強(qiáng)其活性。
相關(guān)鏈接：加強(qiáng)型多功能豬用加酶復(fù)合益生菌，降低臭味、氨氣、蒼蠅密度；降低料耗、促進(jìn)生長(zhǎng)、提前出欄；提升腸道健康水平，提高母豬繁殖性能減少用藥和死亡淘汰率
