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1.1 試驗材料

RSM:購自御康農業科技有限公司。FRSM:將RSM與麥麩按7∶3的比例混合, 然后接種10%的微生物混合菌液 (菌液活菌數≥1×10⁹CFU/mL) , 加1%紅糖, 料水比1.0∶1.2。將上述物質混合均勻后, 裝至發酵桶密封, 厭氧發酵72 h以上, 得到FRSM。發酵菌種:短乳桿菌 (Lactobacillus brevis) 和短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus) 均為本實驗室保藏菌種, 菌種比例為1∶2。FRSM相比于RSM其pH下降了1.68, 營養物質粗蛋白質、水溶性蛋白、酸溶性蛋白和粗脂肪的含量與RSM相比分別提高了1.91%、52.88%、44.40%和24.27%;抗營養因子中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量分別降低了5.21%、0.38%, 異硫氰酸酯降解率達到91.92%, 噁唑烷硫酮降解率達到100.00%。RSM發酵前后營養物質和抗營養因子含量變化見表1。

1.3 飼養管理

動物試驗在重慶市畜牧科學院雙河實驗基地進行, 采用常規飼養管理, 嚴格執行消毒制度。試驗期間, 試驗豬自由采食、自由飲水, 試驗期7周。

1.4 樣品采集與測定指標

1.4.1 生長性能的測定

試驗豬在試驗開始和結束時分別于早晨空腹稱重, 試驗期間記錄每個重復的飼糧消耗, 計算平均日采食量 (ADFI) 、ADG和F/G。

1.4.2 血清生化指標的測定

試驗結束空腹稱重后, 以各組別每個重復為單位, 每組選取6頭豬進行前腔靜脈采血。血樣經3 500 r/min離心10 min, 分離所得血清分裝于Eppendorf管中, 置于-20℃冷凍保存, 待測。

血清葡萄糖 (GLU) 、總膽固醇 (T-CHOL) 、總蛋白 (TP) 、尿氮 (UN) 、甲狀腺素 (T₄) 和三碘甲狀腺原氨酸 (T₃) 含量由重慶市榮昌縣永榮醫院協助檢測, 試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為Glamour 2000全自動生化分析儀。

1.4.3 抗氧化能力指標的測定

血清超氧化物歧化酶 (SOD) 活性用黃嘌呤氧化酶法測定, 血清谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 活性用比色法測定, 血清總抗氧化能力 (T-AOC) 用Fe³⁺還原法測定, 血清丙二醛 (MDA) 含量用硫代巴比妥酸法測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為U-3900型分光光度計, 具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.4 免疫功能指標的測定

血清免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM和腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 含量均采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 試劑盒測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 測定儀器為華東電子DG5033A酶標儀, 具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.5 數據處理

試驗結果用Excel 2010對數據進行初步處理, 再用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析, 若有顯著差異則用Duncan氏法進行多重比較, P<0.05表示差異顯著, P<0.01表示差異極顯著。試驗結果采用平均值±標準誤表示。

2.1 FRSM替代豆粕對生長豬生長性能的影響

由表3可知, 各組的ADFI、ADG和F/G均差異不顯著 (P>0.05) , Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組的ADFI分別比Ⅱ組提高了6.11%、0.56%和2.22%, ADG分別比Ⅱ組提高了12.54%、5.54%和5.67%, F/G分別比Ⅱ組下降了8.54%、7.12%和6.05%。

3.1 FRSM替代豆粕對生長豬生長性能的影響

Tripathi等研究表明, 豬飼糧中添加含GS為1.3~2.8μmol/g的RSM影響采食量, 可能是因為GS引起的苦澀味降低了飼糧的適口性, 并且GS及其降解產物異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮等會引起甲狀腺功能的減退, 進而降低動物的生長性能。研究表明, 通過微生物固態發酵RSM飼喂動物, 能夠改善動物生長性能。Ashayerizadeh等分別用50%和100%的RSM和FRSM替代豆粕飼喂肉仔雞, FRSM組的體增重和飼料轉化率相比于RSM組均顯著提高, 死亡率顯著降低。Chiang等在基礎飼糧中添加10%FRSM飼喂肉雞, 其ADG比添加10%RSM顯著升高, ADFI和飼料轉化率有所提高。本研究結果表明, Ⅲ、Ⅳ組的ADFI、ADG和F/G與對照組差異不顯著, ADFI、ADG相比于Ⅱ組均有所提高, F/G有所下降, 與上述研究結果類似。這說明本研究通過微生物固態發酵RSM, 基本消除了抗營養因子的不良影響, 一定程度上改善了生長豬的生長性能, 并且提高RSM在生長豬飼糧中的添加量, 使FRSM用量提高為16%, 即RSM的用量為11.2%。

3.2 FRSM替代豆粕對生長豬血清生化指標的影響

血清生化指標能夠綜合反映動物機體的新陳代謝狀況。血清中GLU含量是動物機體內能量平衡的重要指標, GLU含量的高低反映了消化吸收作用的增強或減弱。本研究結果表明, Ⅱ組血清中GLU的含量相比于其他各組均有所降低, 但各組差異不顯著。膽固醇穩態是通過調節膽固醇攝取、膽固醇生物合成、膽固醇向膽汁酸的轉化和膽汁酸的排泄來實現的。血清膽固醇含量是飲食中膽固醇 (外源性膽固醇) 和從頭合成膽固醇 (內源性膽固醇) 的結果。本試驗結果表明, Ⅲ、Ⅳ組血清中T-CHOL的含量較Ⅰ、Ⅱ組顯著降低, 可能是因為本研究通過微生物發酵提高了腸道內益生菌的濃度, 益生菌定植在腸道發酵食物中難消化的碳水化合物, 產生短鏈脂肪酸, 其中丙酸會抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA) 還原酶的活性, 而HMG-CoA還原酶又是膽固醇合成的限速酶, 因而起到抑制肝臟膽固醇合成或使膽固醇在血漿和肝臟中再分配, 降低血清膽固醇含量的作用。另外, 本研究發酵所用短乳桿菌具有較高的膽鹽水解酶活性, De Smet等用具有膽鹽水解酶活性的短乳桿菌飼喂高膽固醇飲食的豬, 發現其血清中T-CHOL和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 含量與對照組相比顯著降低, 并且其糞便中總膽汁酸的排泄量也明顯增加。這可能是因為膽鹽水解酶能夠降解膽酸鹽, 使腸道內的膽鹽被解離后, 溶解度降低, 不易被腸道回收, 促進體內膽汁酸向體外排泄, 機體為了彌補肝腸循環中膽汁酸的不足, 肝臟會利用血液中的膽固醇重新合成新的膽汁酸, 從而降低血清中膽固醇含量。Ⅲ、Ⅳ組血清中TP的含量比Ⅰ、Ⅱ組升高, UN含量下降, 可能是因為發酵RSM的益生菌可以利用蛋白質代謝過程中產生的非蛋白氮作為氮源合成菌體蛋白被動物吸收利用, 提高了氮的利用率, 并減少了糞氮的排放, 從而提高了TP的含量。而UN作為蛋白質、氨基酸代謝的終產物, 當氨基酸平衡良好時, UN含量下降 這與Hu等在基礎飼糧中添加9.41%FRSM飼喂肉仔雞, 其血清TP含量顯著升高, 血清UN含量顯著降低的結果一致。甲狀腺激素是人和動物生長發育必不可少的內分泌激素。金邦荃等用高RSM飼糧飼喂豬, 其甲狀腺明顯腫大, 血清中T₄的含量相比于對照組顯著升高, T₄/T₃異常。Mawson等用含高GS的RSM飼喂豬, 其甲狀腺腫大, 血清T₃和T₄含量升高。本研究結果表明, Ⅱ組血清中T₄的含量相比于Ⅳ組顯著升高, 血清T₃的含量相比于其他3組極顯著升高, 與上述結果類似。這可能是因為RSM中抗營養因子GS的降解產物硫氰酸鹽陰離子是碘的競爭者, 通過主動轉運穿過細胞膜結合到甲狀腺球蛋白的酪氨酸殘基上, 阻礙甲狀腺對碘的吸收, 干擾甲狀腺球蛋白分解, 引起T₃和T₄分泌異常, 誘發缺碘性甲狀腺功能亢進。Anke等以RSM為基礎飼糧飼喂生長豬, 飼糧中補充碘 (1 mg/kg) 降低了硫氰酸鹽陰離子對甲狀腺的影響, 從而改善了生長豬的生長性能。本研究結果表明, Ⅲ、Ⅳ組血清中T₃和T₄含量與Ⅰ組差異不顯著, 這與Xu等分別用33%、67%和100%的FRSM替代豆粕飼喂肉鴨, 其血清T₃和T₄的含量與對照組沒有顯著差異的報道一致, 說明通過微生物發酵有效降低異硫氰酸酯的含量, 緩解了甲狀腺功能亢進。

3.3 FRSM替代豆粕對生長豬抗氧化能力的影響

機體的抗氧化酶體系 (如SOD、GSH-Px、T-AOC等) 可在不同水平上清除體內多余的自由基, 恢復機體正常的細胞代謝和功能。MDA是脂質過氧化作用的終產物, 測定血清中MDA含量能直接反映細胞膜被氧化的程度, 血清MDA含量顯著升高意味著機體自由基增多, 細胞受損程度增強。Hu等在肉仔雞試驗上的結果表明, FRSM組相比于RSM組提高了血清T-AOC和SOD活性, 降低了MDA的含量, 這與本研究Ⅲ、Ⅳ組血清中SOD的活性高于Ⅰ、Ⅱ組, 且MDA的含量低于Ⅰ、Ⅱ組的結果一致。本研究通過微生物固態發酵RSM, 其水溶性蛋白和酸溶性蛋白含量相比于RSM分別提高了52.88%和44.40%, 而酸溶性蛋白主要由游離氨基酸和小肽組成。有研究表明, 通過固態發酵RSM會產生具有較強還原力的小肽, 這些小肽對羥基自由基 (·OH) 和二苯基苦基苯肼 (DPPH) 自由基清除能力較強, 而且小肽的分子質量越小, 其清除自由基的能力越強, 即抗氧化活性越強。

3.4 FRSM替代豆粕對生長豬免疫功能的影響

血液中的IgG、IgA和IgM含量的高低直接反映了動物機體全身的體液免疫狀況。TNF-α是由內毒素激活的巨噬細胞和淋巴細胞等分泌的一種多活性的細胞因子, 是機體免疫防護的重要介質, 正常水平的TNF-α可以調節免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起腫瘤細胞凋亡等。吳東等用FRSM等氮替代7.5%豆粕, 生長豬血清中IgA、IgG和白細胞介素 (IL) -2的含量顯著升高, IgM、IL-1、IL-6和TNF-α含量無顯著影響。王尚榮在基礎飼糧中添加4%、6%和8%FRSM飼喂櫻桃谷鴨, 45日齡時血清中IgG、IgA、IgM含量均比對照組略有提高, 但差異不顯著, 60日齡時添加8%FRSM血清中IgG、IgA、IgM含量相比于對照組均顯著升高。本研究結果表明, 各組血清中IgA、IgG、IgM的含量差異不顯著, Ⅳ組血清中TNF-α的含量相比于Ⅲ組顯著降低, 但與Ⅰ、Ⅱ組差異不顯著, 說明Ⅳ組免疫功能沒有受到負面影響。