微生物發酵生產高蛋白多肽菜籽粕的研究
摘要:以菜籽粕為原料,以菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量為評價指標,通過植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌的單菌發酵和混菌發酵實驗,進行最佳菌種組合和發酵條件的研究。結果表明:單菌發酵黑曲霉菌效果最好,菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量分別為38.4%和3.682%;混菌發酵最佳菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌,其接種量分別為4%、6%、6%,優化發酵條件為水料比1.7∶1,34℃下發酵48h。在上述條件下菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量分別為42.5%和7.86%,硫甙含量降至21.637μmol/g、植酸含量為0.27%、單寧含量為0.41mg/g,得到高蛋白、多肽、低毒的菜籽粕飼料。
我國是世界上主要的油菜生產國,每年榨油產生的菜籽粕約600萬 t,菜籽粕中含有35%~45%的蛋白質。菜籽粕中蛋白質含量豐富,但在畜禽養殖中作為蛋白質飼料添加量卻遠低于大豆粕,主要原因一是菜籽粕中含有大量的抗營養因子,二是菜籽粕中蛋白質的消化率較低。目前,國內外對菜籽粕的研究多集中在去除抗營養因子方面,對提高菜籽粕消化率的研究還較少。
目前,提高菜籽粕消化率主要通過降低菜籽粕中纖維素、木質素等物質含量和提高菜籽粕中蛋白質分解的多肽類物質含量來實現。國內外采用的方法主要有物理處理法、化學處理法、酶處理法、微生物發酵法。微生物發酵法相對于其他方法具有成本低、營養損失少、操作簡單、無污染等特點,是理想的提高菜籽粕蛋白質含量和多肽含量的方法。
本研究利用前期篩選的對菜籽粕中抗營養因子去除作用明顯的植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌加上黑曲霉菌對菜籽粕進行單菌和混菌發酵實驗,研究各菌種對菜籽粕中粗蛋白質含量和多肽含量的影響,選出最佳的菌種組合和發酵條件,以獲得低毒、高蛋白多肽的菜籽粕飼料,為菜籽粕的應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 菌種
植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為本校實驗室前期篩選的對菜籽粕中抗營養因子去除作用明顯的保存菌種。黑曲霉菌(Aspergillus niger)由江西四特酒業有限責任公司提供。
1.1.2 原料
菜籽粕:由江西金佳谷物股份有限公司提供,水分含量11.2%,粗蛋白質含量36.2%,多肽含量1.11%,硫甙含量96.526μmol/g,粉碎過40目篩備用。麩皮:本地市售,含水量11.8%,粗蛋白質含量15.1%,粉碎過40目篩備用。
1.1.3 培養基
植物乳酸菌為MRS培養基,黑曲霉菌為察氏培養基,枯草芽孢桿菌為牛肉膏蛋白胨培養基。
1.2 實驗方法
1.2.1 種子及種子液的制備
將保存的菌種斜面接2環到各菌種增殖培養基。植物乳酸菌接種到MRS培養基,38℃,靜置培養48h;枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養基,在30℃、120r/min 振蕩培養48h;黑曲霉菌接種到察氏培養基,28℃、120r/min振蕩培養48h;從上述增殖菌液中,以5%的接種量分別接到各菌的發酵種子培養基中(培養基成分同各菌增殖培養基),培養24h,制成發酵種子液。
1.2.2 固態發酵培養
首先制備固態發酵培養基。將菜籽粕、麩皮(按添加量9∶1的配比)裝入200 mL三角瓶中,攪拌均勻,按不同的水料比加入水,塞緊棉塞,裹牛皮紙封口,115℃滅菌20min,出鍋冷卻后打散備用。其次將各菌種的發酵種子液以不同的接種量加入滅菌的固態發酵培養基中,攪拌均勻,封口發酵。發酵過程中定時取樣,烘干粉碎,測定樣品中粗蛋白質含量和多肽含量。
1.2.3 單菌發酵實驗
按照1.2.2方法分別將各菌以6%接種量接入成分相同的固態發酵培養基(水料比 1.5∶1)中,溫度34℃進行單菌發酵實驗,發酵48h時采樣測定樣品中粗蛋白質含量和多肽含量。
1.2.4 混菌發酵菌種組合正交實驗
將3種菌種按3種接種量進行三因素三水平正交實驗,水料比1.5∶1,發酵溫度34℃、發酵時間24h等發酵條件不變,采用L27(313)正交實驗設計,以粗蛋白質含量和多肽含量為指標確定混菌發酵菌種的最佳組合和接種比例,研究影響混菌發酵效果的主次菌種。
1.2.5 混菌發酵條件正交實驗
設定水料比、發酵溫度、發酵時間的三因素三水平的正交實驗,采用混菌發酵選出的最佳菌種組合和接種比例,采用L9(34)正交實驗設計,以粗蛋白質含量和多肽含量為指標確定發酵條件各因素對混菌發酵效果的影響,優化混菌發酵的條件。
1.2.6 相關指標測定
粗蛋白質含量的測定:凱氏定氮法。多肽含量的測定:三氯乙酸法(TCA法)。
1.2.7 數據處理
本實驗數據處理采用SAS 9.0軟件中的ANONA和GLM語句的方差分析程序;多重比較采用 Duncan 進行。
2 結果與分析
2.1 單菌發酵實驗
2.1.1 各菌種對發酵菜籽粕粗蛋白質含量的影響(見圖1)
由圖1所示,各菌種對發酵菜籽粕中粗蛋白質含量均有一定的提高,其中以黑曲霉菌發酵菜籽粕中粗蛋白質含量最高,達到38.4%,相對于空白樣(粗蛋白質含量 34.09%)提高4.31個百分點。枯草芽孢桿菌發酵菜籽粕中粗蛋白質含量也較高,達到37.9%。這可能與黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的酶系含有纖維素酶、木質素酶、多糖酶等有關,其能夠分解纖維素和木質素等多糖類物質生產菌體蛋白,同時提高蛋白質在菜籽粕中的相對含量。
2.1.2 各菌種對發酵菜籽粕多肽含量的影響(見圖2)
由圖2所示,各菌種對菜籽粕多肽含量均有一定的影響,黑曲霉菌發酵菜籽粕中多肽含量最高,達到3.682%,相對于空白樣1.002%,提高2.68個百分點。其次為枯草芽孢桿菌,多肽含量最低的為植物乳酸菌。研究發現,黑曲霉具有較高的分泌蛋白酶的能力,可以將蛋白質進一步分解為多肽類物質,與本實驗的結論相同。枯草芽孢桿菌同樣具有分泌蛋白酶的特性,其發酵菜籽粕中多肽含量僅次于黑曲霉菌。植物乳酸菌發酵菜籽粕中多肽含量最低,這可能與植物乳酸菌的酶系以糖酶、脂肪酶、產酸酶為主,對蛋白質的分解能力較差,無法將菜籽粕中的蛋白質進一步分解為多肽類物質。
2.2 混菌發酵菌種組合正交實驗
按照1.2.4實驗方法進行混菌發酵菌種組合正交實驗。正交實驗因素水平見表 1,混菌發酵菌種組合L27(313)正交實驗設計及結果見表2。
由圖2所示,各菌種對菜籽粕多肽含量均有一定的影響,黑曲霉菌發酵菜籽粕中多肽含量最高,達到3.682%,相對于空白樣1.002%,提高2.68個百分點。其次為枯草芽孢桿菌,多肽含量最低的為植物乳酸菌。研究發現,黑曲霉具有較高的分泌蛋白酶的能力,可以將蛋白質進一步分解為多肽類物質,與本實驗的結論相同。枯草芽孢桿菌同樣具有分泌蛋白酶的特性,其發酵菜籽粕中多肽含量僅次于黑曲霉菌。植物乳酸菌發酵菜籽粕中多肽含量最低,這可能與植物乳酸菌的酶系以糖酶、脂肪酶、產酸酶為主,對蛋白質的分解能力較差,無法將菜籽粕中的蛋白質進一步分解為多肽類物質。
2.2 混菌發酵菌種組合正交實驗
按照1.2.4實驗方法進行混菌發酵菌種組合正交實驗。正交實驗因素水平見表 1,混菌發酵菌種組合L27(313)正交實驗設計及結果見表2。
由表3所示,在混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量的各菌種中,黑曲霉菌的影響達到差異顯著水平(P<0.05),其他各菌種的影響未達到差異顯著水平(P>0.05),說明黑曲霉菌是混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量的主要因素。實驗結果表明,混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量的菌種組合中黑曲霉菌是必備的。各菌種在混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量的影響中沒有顯著的交互作用。
在混菌發酵提高菜籽粕多肽含量的各菌中,黑曲霉菌的影響達到差異極顯著水平(P<0.01),枯草芽孢桿菌的影響達到差異顯著水平(P<0.05),說明提高菜籽粕多肽含量主要受黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的影響,植物乳酸菌的影響未達到差異顯著水平(P>0.05)。各菌種在混菌發酵提高菜籽粕多肽含量的影響中沒有顯著的交互作用。因此,混菌發酵提高菜籽粕多肽含量需要添加黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌。
綜合考慮,混菌發酵中黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌對提高菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量作用明顯,是必須添加的。因此,選擇黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌接種量均為 6%(表2中的實驗號18和實驗號26)。由于植物乳酸菌在前期篩選中對硫甙去除作用明顯,為獲得高蛋白多肽菜籽粕的同時保證菜籽粕的低毒,選擇按4%接種量添加植物乳酸菌。因此,混菌發酵菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌,接種量分別為4%、6%、6%。
2.3 混菌發酵條件正交實驗
按照2.2選出的最佳菌種組合(植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%)進行混菌發酵接種,按照1.2.5實驗方法進行混菌發酵條件正交實驗。混菌發酵條件的正交實驗因素水平見表4,混菌發酵條件L9(34)正交實驗設計及結果見表5。
由表5所示,對混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量影響因素最大的是發酵時間,其次是水料比,影響最小的是發酵溫度;各因素的較優水平為發酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發酵時間48h。混菌發酵提高菜籽粕多肽含量影響因素最大的是發酵時間,其次是水料比,影響最小的是發酵溫度;各因素的較優水平為發酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發酵時間48h。
利用SAS 9.0對上述正交實驗的結果進行方差分析,結果見表6。
由表6所示,在混菌發酵提高菜籽粕粗蛋白質含量的各因素中,發酵時間的影響達到差異顯著水平(P<0.05),發酵溫度和水料比的影響差異不顯著(P>0.05)。在混菌發酵提高菜籽粕多肽含量的各因素中,發酵時間、發酵溫度、水料比的影響均達到差異極顯著水平(P<0.01),表明各菌種產蛋白酶分解多肽的過程對各發酵因素比較敏感。
綜合分析,采用植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%,在發酵溫度4℃、水料比1.7∶1、發酵時間48h條件下進行混菌發酵,發酵菜籽粕粗蛋白質含量為42.5%,多肽含量為7.86%。并在上述條件下對菜籽粕發酵前后的營養成分進行測定,結果見表7。
由表7所示,發酵后的菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量較發酵前均有所增加,菜籽粕中的抗營養因子硫甙含量、植酸含量及單寧含量都較發酵前大幅下降。可見菜籽粕經混菌發酵后質量得到了提高。
3 結論
(1)在單菌發酵實驗中,菜籽粕經植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌發酵48 h后粗蛋白質含量和多肽含量均有提高,其中黑曲霉菌的作用最明顯,菜籽粕粗蛋白質含量和多肽含量分別達到38.4%和3.682%。
(2)混菌發酵效果優于單菌發酵,混菌發酵的最佳菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%,優化的發酵條件為水料比 1.7∶1、34℃下發酵48h。在上述最優條件下菜籽粕粗蛋白質含量42.5%,多肽含量7.86%,抗營養因子硫甙含量降至21.637μmol/g、植酸含量0.27%、單寧含量 0.41mg/g,得到高蛋白、多肽、低毒的菜籽粕飼料。
實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術
當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺,而棉菜籽餅(棉籽粕、菜籽粕)價格相對便宜,棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣,蛋白質含量較高,含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質,這些物質含有一定的毒性,還會影響動物的消化吸收,不能大量使用,因此不建議直接飼喂給動物!
現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術,可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料,直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅(發酵前的重量)代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物,在發酵過程中分泌的代謝產物,可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。
豆粕、菜粕、棉粕成分對比
1.豆粕是一種高蛋白原料,無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%,賴氨酸含量為2.5%-3.0%,色氨酸含量為0.6%-0.7%,蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。
2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間,特點是蛋氨酸含量高(僅次于芝麻餅、粕),賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低,是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低(淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用)。礦物質中,鈣和磷的含量均高,硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。
3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%,僅次于豆粕的蛋白質含量48%,而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%,而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%,只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。
是否需要脫毒處理
1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸,在不需要額外加入動物性蛋白的情況下,僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜,促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時,豆粕才有可能被替代。
2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分,其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒,但在一定溫度和水分條件下,經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大,從而造成動物生長速度下降,繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化,降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝,造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理,并且使用時要加以限制,具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大,而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時,應結合菜粕的氨基酸組成特點,適當搭配其它餅粕。
3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸,尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中,由于蒸炒,壓榨等熱作用,大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚,結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收,故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中,這部分游離棉酚對動物毒性較大,尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長,可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降,甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害,因此,在使用棉餅、粕時,要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下,棉籽餅、粕的用量不受限制,不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量,最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時,使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡,尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低,且利用率差,應注意添加賴氨酸。
發酵操作技術
發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術,具體操作如下:
1.仔細檢查棉菜籽餅,剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分,輕度發霉的原料可以忽略,因為微生物發酵能夠脫霉。
2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等,調節飼料營養比例。
3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉(其它淀粉、面粉次粉等也可以,或者粉碎的生紅薯300公斤也可以)100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包(500g/包,市場售價約25元,以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑)。
4.在混合物料中添加適量水分,使混合物料含水量保持在55%左右,以“手抓一把并緊握,無水滴落,松手后輕觸即散”為宜,一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。
5.發酵方式根據實際環境條件各異,在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。
6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患,要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。
7.發酵時間受環境溫度影響,通常夏季發酵2-3天,冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后,有較為強烈的酸香味,ph值在3-4。
規模運用混合發酵現場
塑料缸、飼料袋(有內膜)均可做發酵飼料
采用池子發酵
發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術
需要注意的是,發酵后的飼料酸度較低,不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況,將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中,發酵完成的棉菜粕為濕料,具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕(濕料)代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用,與其它飼料混合后直接飼喂,由于棉菜籽粕蛋白較高,最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%(濕料重量)。如果發現發酵飼料過酸適口性變差,可在飼喂前在陽光下曬1-2小時,或添加適量的碳酸氫鈉(小蘇打)即可改善。
發酵過程中與發酵后使用過程中,發酵的容器要一直保持密封狀態,可以長時間保存(一年左右)。
當前養殖業成本高居不下,而飼料成本是其中最高的,利用廉價原料發酵飼料(包括一些輕度發霉的粕類低價收回)是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用,可以將輕度霉變飼料變成優質飼料,將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等,可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香,提高了飼料的適口性,加上發酵飼料中有大約4℃的酒度,能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病,是當前養殖業發展中重要的一環。
本技術也可以同樣發酵菜籽粕(餅)、棕櫚粕等,方法同上。
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2020年已全面禁抗,我們之前經常在飼料中添加的抗生素進行促生長行為將是違法,否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進動物生長又能夠形成無抗養殖呢?其實中草藥在促進畜禽養殖健康和生長、改善肉蛋奶品質大有可為,特別是將中草藥發酵后效果提升4-28倍等好處,這個實施方案比你想象中效果更好,運用的沒有不被效果折服的,值得嘗試驗證
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