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導讀

我國是一個農業大國, 作物秸稈作為農業重要的副產品, 資源總量已超過8億噸。秸稈因其營養品質及適口性差, 消化率低, 飼用化率僅為26%左右。近年來, 利用發酵技術將秸稈纖維轉化為動物易消化吸收的蛋白飼料已成為一個研究熱點。目前存在的主要問題是菌種單一、酶系不全、發酵周期長、轉化效率低。

本研究根據不同微生物的代謝特征和協同機理, 考察混合菌群發酵小麥秸稈合成菌體蛋白的菌種配比及其接種順序等影響蛋白產率的關鍵因素, 以達到發酵過程中菌群間的協調、互補作用。

1實驗與方法

1.1 實驗材料1.1.1 菌種

米曲霉 (Aspergillus oryzae) 、熱帶假絲酵母 (Candida tropicalis) 由陜西省酶工程研究所提供;產朊假絲酵母菌 (Candida utilis) 、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 由陜西省微生物研究所提供。

1.1.2 原料

纖維素酶由陜西省科學院酶工程研究所提供, 酶活力單位為1.4×105U/g。小麥秸稈產于陜西省西安市臨潼區, 含水量9.18%, 粉碎后待用。本文所用小麥秸稈質量均以絕干物料計量。

1.1.3 培養基

(1) 液體種子培養基

a.米曲霉培養基:蔗糖3%, NaNO30.3%, MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4·4H2O0.001%, K2HPO40.1%。

b.酵母菌培養基:葡萄糖2%, 蛋白胨1%, 酵母膏0.5%。

c.枯草芽孢桿菌培養基:蛋白胨0.5%, 肉膏0.3%, NaCl 0.5%, pH自然。

(2) 發酵培養基

小麥秸稈100g, 無機鹽溶液300mL (組成為:尿素1.2%, (NH4) 2SO41.5%, MgSO4·7H2O0.05%, KH2PO40.2%) 。

1.2 實驗方法1.2.1 預處理方法

發酵培養基滅菌后, 采用纖維素酶進行發酵前預處理, 使秸稈中的纖維素降解為單糖或低聚糖, 為后期微生物合成單細胞蛋白提供碳源。最適的酶解條件為:加酶量40U/g, 反應溫度40℃, 酶解時間10h, 總糖含量43.24%。

1.2.2 分析方法

粗蛋白含量測定采用微量凱氏定氮法, 纖維素酶活力測定采用3, 5-二硝基水楊酸法 (DNS顯色法)。

1.2.3 工藝流程

新的發酵工藝流程如下:

2結果與討論

2.1 菌種篩選

將各發酵菌種的種子液按表1中的組合方式及順序 (組合1為對照組, 不添加任何菌種) 接入經纖維素酶水解后的固體培養基中, 各接種量均為5%, 30℃靜置發酵24h。定時攪拌以保持發酵物料各部位均勻, 防止結塊。結束后烘干, 測定粗蛋白含量。

五種組合對蛋白質含量的影響見圖1。由圖1可知, 組合5為最優的菌種組合, 因此選擇米曲霉、產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌作為混合發酵的菌種。

2.2 接種順序及時間對蛋白質產量的影響

米曲霉可產生纖維素酶, 發酵前期應作為先導菌進一步分解殘留的粗纖維, 為后期微生物合成菌體蛋白提供充足的碳源。在生產蛋白質的菌株中, 酵母菌在營養豐富的環境中繁殖最旺盛, 一些代謝產物又是細菌的營養物質。因此我們將接種的時間順序設計為:米曲霉→產朊假絲酵母→枯草芽孢桿菌。此外, 如何控制接入各菌種的時間, 以達到菌種之間的協調、互補作用, 也是影響粗蛋白產率的關鍵因素之一。

實驗采用分段接種法, 先將米曲霉種子液接入發酵培養基中進行發酵, 考察不同時間段接入酵母菌及枯草芽孢桿菌對合成粗蛋白產量的影響, 各接種量均為5%。

2.2.1 產朊假絲酵母的接種時間對粗蛋白產量的影響

分別于米曲霉發酵過程中的不同時間段接入酵母菌種子液, 3h后再接入枯草芽孢桿菌種子液。于30℃靜置發酵24h, 取樣烘干, 測定粗蛋白含量。由圖2可知, 12h左右接入酵母菌的粗蛋白產量最高, 為11.16%。

2.2.2 枯草芽孢桿菌的接種時間對粗蛋白產量的影響

接種米曲霉發酵12h后, 再接種產朊假絲酵母, 然后分別于不同時間接入枯草芽孢桿菌種子液, 繼續發酵24h, 取樣烘干, 測定粗蛋白含量。

由圖3可知, 接種酵母菌8h后再接入枯草芽孢桿菌的粗蛋白產量最高, 為12.59%。

2.3 發酵培養基的優化

本著以粗代精、以廢代好、降低成本的原則, 對發酵培養基進行優化。麩皮含有豐富的蛋白質、碳水化合物、維生素及微量元素, 可為微生物發酵提供天然的有機碳源、氮源和營養因子。實驗考察了發酵培養基中秸稈與麩皮的不同配比對生物合成蛋白質的影響。由圖4可知, 秸稈與麩皮的最適配比為3∶1, 粗蛋白產量為23.19%。

2.4 部分顯著因素的正交試驗

在對微生物發酵體系中各參數進行不同水平測定的基礎上, 確定了影響菌體蛋白產量的主要因素是接種量、菌種比例、發酵溫度、發酵時間、秸稈與麩皮配比。因此, 選擇上述五項為主要因素, 采用L16 (45) 正交試驗表進行5因素4水平的正交實驗, 以考察上述因素之間的相互影響和各因素水平的變化, 結果如表2所示。

通過直觀分析法, 從表3的極差分析可知, 在所選的因素水平范圍內, 秸稈與麩皮的比例對發酵體系影響較大, 各因素影響的主次順序為:E>B>D>A>C, 并確定了最佳條件組合為A2B2C1D4E3, 即接種量為10%, 接種比例為1∶2∶1, 發酵溫度為28℃, 發酵時間48h, 秸稈與麩皮配比為4∶1。通過發酵, 物料中粗蛋白含量由起始時的5.47%提高到27.13%。

3最佳發酵條件下動力學模型的建立

微生物發酵反應過程非常復雜, 利用數學擬合模型構建發酵動力學模式, 具有簡單、易于分析驗證和實現計算自動化的特點。建模的目的是為了更深刻的了解微生物復雜的代謝本質, 從而尋求最適的操作條件, 實現發酵過程的最優化。

3.1 動力學模型的選擇

描述菌體生長動力學最常用的是Monod方程和Logistic方程, 其中Monod方程假設菌體生長為均衡型非結構式生長, 細胞成分只需要用一個參數即菌體濃度表示;培養基中只有一種底物是生長限制性底物, 其它組分含量充分, 不影響微生物生長;將微生物生長視為簡單反應, 并假設菌體得率為常數, 沒有動態滯后。在秸稈發酵過程中, 采用的混合菌群包括霉菌、酵母菌和細菌, 由于不同菌株之間的相互作用、生長環境的改變、代謝產物的反饋抑制以及營養物質的擴散限制, 導致菌體生長遲緩等異常現象, 故不宜采用Monod方程來描述此過程。

Logistic方程是一個典型的S曲線, 能很好的反應混合菌群發酵小麥秸稈過程中菌體濃度的增加對自身生長的抑制作用, 具有廣泛的適用性。由于菌體量和蛋白增加量存在某一統計學意義上的相互關聯, 故可以用宏觀的蛋白質含量變化來間接描述菌體的生長過程。

3.2 動力學方程的參數確定

動力學方程對于了解發酵機理、掌握整個發酵過程中混合菌群生長的動態變化、優化發酵工藝具有重要的指導意義。設X、X0、Xm、K分別為粗蛋白含量的增加量 (%) 、初始增量 (%) 、最大增加量 (%) 和比生長速率常數 (h) , 則:

應用Origin7.5軟件中的非線性方程Slogistic3, 將表4中最適條件下發酵反應實驗數據進行最優化擬合, 結果如圖5所示。實驗數據和擬合曲線基本吻合, 且最大粗蛋白增加量Xm=23.38%, 比生長速率常數K=0.15/h, b=46.81;最大誤差分別為±0.45、±0.008 6和±8.9, 誤差值均低于10%, 說明該方程能夠近似描述混合菌群發酵秸稈合成蛋白質的菌體生長過程。令粗蛋白增加速度為

, 因此, 發酵過程中粗蛋白的增加量隨著時間變化的數學模型為:

作粗蛋白量增加速度v和加速度dv/dt隨時間t的變化曲線, 結果如圖6和圖7所示。

由圖6和圖7可知, 粗蛋白增長速度在26h左右達到最大, 即vmax=0.87%/h。在16h和35h左右dv/dt達到峰值, 即dv/dt=±0.05%/h2。由此可以認為, 在16h以前為發酵的延遲期, 35h以后為發酵的衰亡期, 這之間的時間段為發酵的對數增長期和穩定期。圖中曲線反應了整個發酵過程中混合菌群生長的內部變化規律, 可作為控制發酵生產周期的重要依據。

根據微生物群體的生長規律, 穩定期細胞濃度達到極大值, 發酵產物在此階段形成和積累。動力學分析表明, 正交實驗所顯示的最適發酵時間48h已是混合菌群的衰亡期, 發酵合成菌體蛋白的發酵時間應控制在穩定期末期即35h結束, 此時收獲的發酵產品既保證了較高的蛋白含量, 而且有害代謝產物少, 粗蛋白含量為25%左右。

4結論

本實驗設計的最適分段接種工藝為:首先接種米曲霉, 發酵12h后再接種產朊假絲酵母, 繼續發酵8h再接種枯草芽孢桿菌。以麩皮作為天然的有機碳源和氮源可以大大降低生產成本。對發酵培養基優化后的組成為:小麥秸稈與麩皮配比為4∶1, 1.5% (NH4) 2SO4, 0.05%MgSO4·7H2O, 0.2%KH2PO4和1.2%的尿素, 料液比為1∶3。

正交實驗表明, 影響發酵主要因素的主次順序為:秸稈與麩皮配比>接種比例>發酵時間>接種量>發酵溫度;發酵的最適條件為:總接種量為10%, 米曲霉、產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌的接種比例為1∶2∶1, 發酵溫度為28℃, 發酵時間48h。發酵產物中粗蛋白含量達到27.13%。

動力學分析有助于了解整個發酵過程中混合菌群生長的內部變化規律, 可作為控制發酵生產周期的重要依據。本研究表明, 發酵的穩定期在26~35h之間。因此, 將最適發酵周期由48h優化為35h, 發酵產物的粗蛋白含量為25%左右。

本研究在前期利用纖維素酶降解小麥秸稈的基礎上, 通過混合菌群的協同發酵作用, 有效轉化秸稈粗纖維, 提高了菌體蛋白含量;對微生物生長動力學模型進行探討, 確定了相關的動力學參數, 改進了發酵工藝條件, 具有發酵周期短、有害代謝產物少、減少能耗、生產成本低, 蛋白質含量高的特點, 對于將秸稈纖維轉化為蛋白飼料的發酵工藝的優化提供了參考。