摘要：為了探究高效的羊肉蛋白的酶解工藝以及酶解液中氨基酸種類與含量，試驗采用凍干羊肉粉為原材料，以酶解液中氨基酸肽氮的含量為水解度的評價指標，選擇堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加總量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解溫度、pH值以及酶解時間為自變量進行單因素試驗，篩選部分因素進行五因素三水平的正交試驗，同時測定最終酶解液游離氨基酸的種類與含量。結果表明：最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量為5%、添加比例為1：3，酶解溫度為50℃， pH值為8.0，羊肉蛋白含量為4%，酶解時間為8h，在該條件下復合酶對羊肉蛋白水解度為43.7% 。酶解液中有20種氨基酸，總含量為1 288.98 mg / 100mL；游離氨基酸含量分為4個區段，其中亮氨酸含量最高（214.42 mg/100mL），色氨酸含量最低（8.63 mg /100mL）。說明優化后的酶解工藝合理可行，且具有較好的酶解效果以及較低的時間成本。

我國是羊肉生產與消費大國，2017年，我國羊肉年生產總量為467. 5萬t，年人均羊肉消費量為3. 5 kg，在所有肉類消費中羊肉占比超過5% 。目前，我國肉羊的屠宰及初加工場區大多在牧草豐富的西北地區，由于當地經濟水平及監管、規范力度相對不足，使得肉羊屠宰初加工中產生大量的屠宰副產品無法得到有效的利用，肉羊屠宰副產品的處理多采用酶解法、化制法以及微生物發酵法等。目前，對于肉羊屠宰副產品處理的研究主要集中于骨、血液、內臟以及油脂等副產品，其處理產物多用于制備工業油、骨粉、肥料以及燃料等。在眾多處理方法中，酶解法是最為環保、安全的方法，其中單一酶解法的酶解效果普遍較差，因此復合酶解法成為了常用的酶解方法之一。酶解法中常用的酶有堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠蘿蛋白酶等。研究結果表明，木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶常用于植物的酶解及肉的嫩化，木瓜蛋白酶對蛋白胨的酶解效果較差，菠蘿蛋白酶在水中溶解度較低且對肌纖維蛋白原酶解效果較差；堿性蛋白酶對肽鍵、酰胺鍵以及酯鍵等均有良好的水解效果；風味蛋白酶具有改善酶解產品質量、降低成本及提高水解度等優點，因此常用于骨/肉副產品加工等領域。綜上所述，本試驗提出利用堿性蛋白酶與風味蛋白酶組成的復合酶對羊肉的酶解工藝進行優化探究，選出最優酶解條件并測定酶解液中氨基酸的含量，為其在氨基酸有機肥以及飼料添加劑等方面的應用提供參考，以及為屠宰副產品的高價值二次利用提供理論依據。

1 材料

1.1供試羊肉樣品與酶類

羊肉樣品為蘭州大尾羊屠宰過程中產生的碎肉殘渣，由蘭州市忠華屠宰場提供。堿性蛋白酶（40萬μ/g）、風味蛋白酶（20萬μ/g）。

1.2主要試劑與儀器

甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯乙酸、茚三酮(均為分析純)

2、方法

2.1羊肉樣品前處理與其蛋白質含量的測定

用絞肉機攪碎肉樣后，將其置于真空冷凍干燥機中，-40℃下冷凍干燥36 h，取出后罐裝密封保存，備用。參照《食品中蛋白質的測定》（GB 5009. 5-2016）中的凱氏定氮法測定肉樣中蛋白質含量。

2.2單因素試驗及酶解體系

2.2.1單因素試驗探究

堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量（1%、2%、3%、4%、5%）、堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）羊肉蛋白含量（4%、5%、6%、7%、8%），pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、酶解溫度（40，45，50，55，60℃）,酶解時間（2，4，6，8，10 h）對羊肉樣品蛋白質水解度的影響。參照《食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009. 235-2016）中的甲醛滴定法測定肉樣蛋白質水解度。

2. 2. 2酶解體系

在500mL錐形瓶中加入100mL純化水，再按照計算公式加入凍干羊肉粉(計算公式：W1= W2/N，W1為加入凍干羊肉粉量；W2為所需粗蛋白量；N為測得凍干羊肉粉中粗蛋白的含量)，然后加入不同比例的堿性蛋白酶與風味蛋白酶(加入量按占凍干羊肉粉中粗蛋白量的百分比計算)，用0.05mol/L鹽酸與0. 05mol/L氫氧化鈉調整酶解體系pH值，之后將酶解體系放入恒溫搖床定時反應，每個試驗重復5次。

2. 3正交試驗

在單因素試驗基礎上，以蛋白質水解度為指標，以酶解溫度、pH值、羊肉蛋白含量、堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量、堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加比例為考察因素，設計L18（35）正交試驗，優化酶解工藝，利用SPSS 22.0軟件進一步對正交試驗結果進行方差分析。

2.4驗證試驗

依據正交試驗中得到的最佳水解條件，進行驗證試驗。

2.5羊肉樣品酶解液中氨基酸含量的測定

按照最佳酶解條件將羊肉樣品酶解后，取酶解液置于100℃水浴中滅活15 min，待酶解液冷卻后用紗布粗濾，然后將樣品經0.45μm濾膜過濾后靜置20 min，再向1mL酶解液中加入0.25mL的20%三氯乙酸，混勻后4℃過夜。取過夜酶解液樣品上清液用0.22μm膜過濾并稀釋20倍后，使用全自動氨基酸分析儀進行酶解液樣品中氨基酸含量的測定。

2.6數據的統計分析

采用SPSS 22. 0軟件對試驗數據進行統計學分析，結果均以“平均值士標準差”表示，對單因素試驗采用新復極差法進行差異顯著性分析，正交試驗結果采用多因素方差分析法進行差異顯著性分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

3、結果與分析

3.1羊肉樣品中蛋白質含量的測定

通過凱氏定氮法測定干燥后的羊肉樣品中粗蛋白含量為77.4%。

3.2單因素試驗

3.2.1堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響結果見圖1。

 由圖1可知，隨著堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量的增加，肉樣中蛋白質的水解度呈先上升后略微下降的趨勢，在添加量為4%時，水解度最大（36.7%），且與1%、2%、3%添加量差異顯著（P

3.2.2堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加比例對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響結果見圖2。

由圖2可知，在堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加比例為1：2時，羊肉樣品的蛋白質水解度達到最大值（36.8%），且較其他各個添加比例差異顯著（P<0.05），之后隨著比例升高，羊肉樣品的蛋白質水解度逐漸下降，綜合考慮選擇復合酶添加比例1 ：1，1：2，1：3進一步優化。

3.2.3羊肉蛋白含量對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響結果見圖3。

在酶濃度保持不變的條件下，一定范圍內，酶促反應速率與底物濃度呈正比。由圖3可知，當羊肉蛋白含量為5%時，羊肉樣品蛋白質水解度達到最大值（39.5%），且與其他各濃度差異顯著(P<0.05)，之后隨著羊肉蛋白含量的升高，羊肉樣品中蛋白質的水解度逐漸下降，綜合考慮選擇底物濃度4%、5%、6%進一步優化。

3. 2. 4  pH值對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響結果見圖4。

 由圖4可知，pH值較低時，羊肉樣品蛋白質水解度隨著pH值升高不斷上升，在pH值為7. 5時達到峰值(41.9%)，之后隨著pH值升高水解度逐漸下降，綜合考慮選擇pH值7.0、7.5、8.0進一步優化。

3.2.5酶解溫度對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響結果見圖5。

由圖5可知，當溫度為50℃時，羊肉樣品中蛋白質水解度達到最大值(40.9%)，且較其他各溫度均差異顯著(P<0.05)，之后隨著溫度的升高水解度逐漸下降，綜合考慮選擇溫度45，50，55℃進一步優化。

3.2.6酶解時間對羊肉樣品中蛋白質水解度的影響

由圖6可知：酶解時間8h內，隨著酶解時間的延長，羊肉樣品中蛋白質水解度較快上升，且各個時間段水解度均差異顯著(P

3. 3正交試驗

在單因素試驗基礎上，以羊肉樣品中蛋白質的水解度作為指標，選擇堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加總量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解溫度、pH值為自變量，進行五因素三水平的正交試驗，設計方案及結果見表1~3。

由表2可知，各因素對于酶解效果的影響程度為A>C>B>E>D，即堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量>酶解溫度>堿性蛋白酶與風味蛋白酶的添加比例>羊肉蛋白含量>pH值，酶解最佳工藝為A3B3C2D3E1，即堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量5%、添加比例1：3，酶解溫度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%。

由表3可知，因素A即堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量對酶解工藝影響極顯著(P<0.05)，因素C即酶解溫度對酶解工藝影響顯著(P<0.05)，說明復合酶添加量與酶解溫度在酶解反應中有重要作用。

3. 4驗證試驗

依據正交試驗中得到的最佳水解條件，進行3次平行驗證試驗，結果表明，在最佳水解條件下（A3B3C2D3E1）得到的水解度為43.7%，高于正交試驗中的最高值42.8%，表明本研究的酶解工藝具有較高的可行性。故確定復合酶對羊肉樣品蛋白質的最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量5%、添加比例1：3，酶解溫度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%，酶解時間8 h。

3. 5酶解液中游離氨基酸種類和含量的測定結果見圖7。

3. 4驗證試驗

依據正交試驗中得到的最佳水解條件，進行3次平行驗證試驗，結果表明，在最佳水解條件下（A3B3C2D3E1）得到的水解度為43.7%，高于正交試驗中的最高值42.8%，表明本研究的酶解工藝具有較高的可行性。故確定復合酶對羊肉樣品蛋白質的最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量5%、添加比例1：3，酶解溫度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%，酶解時間8 h。

3. 5酶解液中游離氨基酸種類和含量的測定結果見圖7。

4、討論

我國肉羊的飼養量及羊肉產量均居世界首位，但目前對其屠宰產生的副產品，尤其是碎肉渣的處理能力相對不足，通常是與其他副產品混合處理，使得碎肉渣的二次利用價值沒有充分開發。因此，本試驗提出利用復合酶酶解技術對肉羊屠宰產生的肉殘渣進行酶解處理，在酶促反應中，酶的催化活性受到眾多因素的影響。本試驗結果表明，當復合酶的添加量達

到5%時，水解度略微下降，說明在底物一定的情況下，過量添加蛋白酶的量，會導致酶分子與底物分子結合相對困難，使得水解度出現略微下降趨勢。同時，本試驗結果表明，復合酶比例超過1：2且隨著風味蛋白酶比例的增加，水解度出現明顯的下降，這可能與堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶切位點不同有關，堿性蛋白酶對肽鍵、酰胺鍵以及酯鍵等均有良好的水解效果，能更大程度將蛋白質水解為大分子肽段，而風味蛋白酶僅對肽鍵有較好的水解效果，因此隨著風味蛋白酶添加比例的增加，水解度有一定程度的下降。

另外，酶促反應體系中，底物蛋白質含量、pH值、酶解溫度、時間等均會影響酶的催化活性。底物羊肉蛋白的含量過高，會增大水解液的黏稠程度，導致蛋白酶在水解液中分布不均，抑制水解反應的進行，且過量的底物與酶分子結合，生成無活性的中間產物，會影響酶的活性。過高的pH值會改變酶分子與底物分子的帶電狀態，從而降低酶與底物的結合效率。溫度過高或過低均會影響酶的活性，溫度過低不僅影響酶活，還會使得酶與底物結合效率降低，抑制酶促反應速率，溫度過高則會導致蛋白酶結構發生不可逆的破壞。長時間的酶促反應可使反應體系逐漸飽和，另一方面，水解產物使反應體系的pH值逐漸下降，酶的活性可受到一定程度的影響。因此，本試驗探究了復合酶對羊肉蛋白質最佳的酶解條件，使羊肉蛋白質最大程度水解為小分子肽以及氨基酸。本試驗結果表明，為保證高水解度低成本的效果，羊肉酶解工藝最佳條件為堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量5%和添加比例1：3,酶解溫度50℃, pH值8.0、羊肉蛋白含量4%，酶解時間8h，在此條件下水解度可達43.7%。  

 本試驗對酶解產物中的氨基酸種類與含量進行了測定，發現酶解產物中含有20種氨基酸，其中亮氨酸與谷氨酸含量顯著高于其他氨基酸，異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸及天冬氨酸為中等含量，而色氨酸含量最低。可見羊肉酶解液中支鏈氨基酸與必需氨基酸含量較高，但支鏈氨基酸含量過高會帶來較差的食用感受，而酶解物中較高含量的谷氨酸可以大幅度提升食用口感。大量研究結果表明，支鏈氨基酸作用較為廣闊，是動物飼料添加劑研究的重點之一。研究發現，仔雞日糧中添加亮氨酸以及異亮氨酸后，仔雞肌肉增長率顯著上升，同時大幅度提高仔雞生長性能。研究結果表明，日糧中添加低劑量的支鏈氨基酸可以顯著減少豬腸道中以及糞便中鏈球菌和銅綠假單胞菌的含量。研究發現，增加日糧中支鏈氨基酸水平能降低肉雞料重比，適宜含量的支鏈氨基酸能促進肉雞腸道生長發育。研究結果表明，日糧中合理添加氨基酸能顯著提高育肥豬的生長性能，有效改善育肥豬機體的免疫能力，縮短育肥周期。說明支鏈氨基酸在促進肌肉增長、抗疲勞、抗肌肉損傷、促進機體發育、調整能量和微生物平衡等方面有著重要作用。由此可見，動物屠宰副產品水解產物的二次利用具有廣闊的應用前景。

5、結論

本試驗通過優化肉羊屠宰廢棄碎肉復合酶酶解工藝，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗進行優化，確定了最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加總量5%和添加比例1：3，酶解溫度50℃，pH值8.0、羊肉蛋白含量4%，酶解時間8h。實際水解度為43.7%，高于正交試驗中的最高值42.8%。對羊肉氨基酸組成的研究結果表明，羊肉酶解液中含有20種氨基酸，支鏈氨基酸與必需氨基含量豐富，且有較高含量的谷氨酸，使得羊肉及其酶解產物具有非常鮮美的食用感受，因此表明羊肉酶解產物在氨基酸肥料、動物飼料添加劑等方面具有很高的應用價值。

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