制作5種不同酶解豆粕添加量的等氮等能飼料(表2)。所有原料經破碎后，過80目篩網，按照飼料配方比例稱重并采用四分法逐級擴散混勻，依次加入油脂和水搓勻，經絞肉機擠壓并制粒，90℃熟化20min，于陰涼通風處晾干，將成品飼料破碎成適合養殖期間各生長階段對蝦采食的飼料粒徑，−20℃冰箱保存。

1.2 養殖管理

實驗用凡納濱對蝦蝦苗購自上海聯旺水產科技有限公司(養殖水體鹽度為5)，蝦苗暫養于水泥池內，逐步淡化，直至水體鹽度降至0。淡化期間，投喂商品蝦片，蝦苗暫養30d，挑選規格整齊、健康的對蝦1000尾，平均分成5組，每組設4個重復，初始均重為(0.45±0.02)g，隨機分配到同一水泥池(5.0m×11.0m×1.2m)中的20個網箱(1.0m×1.0m×1.2m)內，每個網箱內投放50尾幼蝦。每日投喂4次，分別在5:30、10:30、16:30和22:30等4個時間點投喂，日投喂量約占蝦體質量的5%~8%，并根據天氣、攝食情況以及生長階段進行調整。養殖實驗持續8周，養殖期間每周換水2次，進水經200目濾水袋過濾，水體透明度維持在20~40cm。養殖期間保持連續充氣，水體溶氧量控制在6mg/L以上，pH為7.8~8.5，氨氮濃度低于0.2mg/L，水溫為(30±2)℃，水體鹽度為0。

1.3 樣品采集

生長性能測定 養殖8周，停止投喂24h后，逐個網箱稱重、計數。每個網箱隨機取凡納濱對蝦8尾，用1mL一次性無菌注射器于對蝦圍心腔處取血淋巴后置于1.5mL離心管中，放置于冰盒保存；在托盤上快速解剖對蝦，取肝胰腺和肌肉于冰盒保存，并隨機取3尾對蝦的鰓迅速置于盛有RNA保存液(北京天根公司)的1.5mL的離心管中，血淋巴經4℃、10000r/min離心10min取上清液，所有樣品于−80℃冰箱保存。各類生長指標計算方法如下：

成活率(survivalrate，SR，%)=Nt/N0×100%

飼料系數(feed conversion ratio，FCR)=Wf/(Wt-W0)

特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=(lnWt/Nt-lnW0/N0)/t×100%式中，Nt為終末尾數，N0為初始尾數，Wf為每個網箱所投飼料總重(g)；Wt和W0分別為實驗結束和開始時每個網箱蝦總重(g)；t為實驗天數(d)。

高濃度副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)人工急性感染實驗實驗

所用副溶血性弧菌菌株取自上海海洋大學病原庫。8周實驗結束后，每組隨機撈取30尾對蝦，分3個平行，置于15個網箱(50cm×30cm×80cm)中，每個網箱10尾。菌種需經蝦體活化后于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(TCBS)分離培養，預實驗需注射活化菌液于同規格蝦體中，觀察96h內凡納濱對蝦的死亡情況，篩選出最適半致死濃度。根據預實驗結果，每尾蝦腹部注射35μL6.25×107CFU/mL經活化培養后分離的副溶血性弧菌菌液，對照組取同規格對蝦注射無菌生理鹽水。實驗期間持續曝氣，水溫控制在(30±1)℃。注射菌液后連續觀察網箱中各飼料組對蝦的死亡情況，在24、36、48、72、84和96h時分別統計各網箱的累積死亡率。

低濃度副溶血性弧菌人工急性感染實驗

8周實驗結束后，每組隨機撈取75尾凡納濱對蝦，分成3個平行，放置于15個(50cm×30cm×80cm)網箱中，根據預實驗的結果，活菌液用4%甲醛溶液滅活1h，4℃、3000r/min離心10min，取底部離心物用生理鹽水反復沖洗、離心。每尾蝦腹部注射25μL1.25×106CFU/mL經滅活的副溶血性弧菌菌液，對照組取同規格的對蝦注射無菌生理鹽水。養殖水體溫度為(30±1)℃，水體鹽度為0，24h持續曝氣。分別在0、6、12、18、24、30、36、42和48h從每個網箱取3尾對蝦，采集鰓組織并分別存放于裝有RNA保存液(北京天根公司)的離心管中，−80℃保存，用于測定鰓組織中免疫相關基因的相對表達量。

1.4 樣品檢測分析

飼料及凡納濱對蝦肌肉常規檢測分析 飼料和肌肉中的水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法檢測(GB/T 6435—2014)；粗脂肪采用氯仿-甲醇法檢測(GB/T 6433—2006)；灰分采用550℃馬弗爐灼燒法檢測(GB/T 6438—2007)；粗蛋白質采用凱氏定氮儀(KjeltecTM 2300，瑞典)檢測(GB/T 6432—2018)。

血清及肝胰腺生化指標 對蝦肝胰腺用冰浴勻漿處理，稀釋成相應的組織勻漿液，勻漿液于3000r/min、4℃條件下離心10min，取上清液。肝胰腺蛋白酶活性采用Folin-酚法、脂肪酶活性采用對硝基苯酚法、淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法(南京建成試劑盒)。離心后的血清經生理鹽水稀釋后，按照試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)測定各抗氧化指標。

低濃度副溶血性弧菌感染后凡納濱對蝦免疫相關基因表達量檢測 按照Trizol試劑盒(TaKaRa)說明書從對蝦鰓組織中提取總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計測定其OD260nm和OD280mm比值，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。將提取的總RNA用TaKaRa公司PrimeScript@RT reagent Kit with gDNA Eraser(Per-fect Real Time)試劑盒反轉錄為cDNA，−20℃保存。

參照凡納濱對蝦Toll受體mRNA(GenBank：DQ923424.1)、溶菌酶mRNA(GenBank：AYl70126.2)、IMDmRNA(GenBank:FJ592176.1)和β-actin基因(GenBank:AF300705)設計熒光定量引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。

采用RT-PCR儀(Bio-rad公司)按照SYBR@PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)試劑盒(TaKaRa公司)說明書進行熒光定量PCR(RT-PCR)檢測，RT-PCR程序為95℃、30s預變性；95℃、10s，60℃、30s，共39個循環；反應完成后溫度由65℃上升到90℃，測定熔解曲線檢測反應特異性。結果采用相對表達量的形式，根據2−ΔΔCt計算法進行計算。

1.5 數據處理和統計分析

實驗結果用平均數±標準差(mean±SD)的方式表示，數據使用SPSS25.0分析軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較法進行差異顯著性分析，P<0.05則表示為差異顯著。

2 結果

2.1 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦生長性能的影響

8周養殖實驗結束后，各實驗組凡納濱對蝦成活率均在97%以上；各組對蝦終末均重為14.65~15.38g/尾；飼料系數呈現出先下降后升高的趨勢，A組最高；特定生長率呈現出先升高后下降的趨勢，最低組為A組；各組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

2.2 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦肌肉常規組成的影響

凡納濱對蝦肌肉中粗蛋白質含量，A組顯著低于其他各實驗組(P<0.05)，E組最高；對蝦肌肉中粗脂肪含量隨著酶解豆粕添加量的增加，整體呈現升高的趨勢，A組顯著低于C組、D組和E組(P

2.3 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦肝胰腺消化酶的影響

對蝦肝胰腺中蛋白酶活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增加呈升高的趨勢，D組和E組顯著高于A組和B組(P<0.05)；B組、D組和E組對蝦的淀粉酶活性顯著高于A組(P<0.05)；對蝦的脂肪酶活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增加整體呈現出升高的趨勢，D組和E組顯著高于A組(P<0.05)(表6)。

2.4 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦血清溶菌酶和抗氧化能力的影響

隨飼料中酶解豆粕添加量的增多，各組凡納濱對蝦血清溶菌酶活性呈先升后降的變化趨勢，A組最低，D組最高且顯著高于其他各組(P<0.05)；血清中T-SOD活性隨飼料中酶解豆粕添加量的增多而增高，E組最高，且顯著高于其他各組(P<0.05)；血清丙二醛含量隨飼料中酶解豆粕添加量的增多呈現先降后升的變化趨勢，A組最高，且顯著高于其他各組(P<0.05)(表7)。

2.5 飼料中添加酶解豆粕對感染高劑量副溶血性弧菌的凡納濱對蝦成活率的影響

在對蝦腹部注射35μL6.25×107CFU/mL經活化培養后分離的副溶血性弧菌，各組對蝦96h內的累積死亡率顯示，A組對蝦在各個時間點的累積死亡率均高于其他各組，D組對蝦在各個時間點的累積死亡率均低于其他各組，且在48和60h時顯著低于A組(P<0.05)(圖1)。

2.6 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦急性感染副溶血性弧菌后免疫相關基因表達量的影響

凡納濱對蝦人工急性感染副溶血性弧菌后對蝦Toll受體mRNA表達量最大峰值出現在24h、C組，A組于42h出現峰值，B組、C組和E組峰值均大于A組(P<0.05)(表8)。對蝦IMD mRNA表達量最大峰值出現在42h、B組，飼料中添加酶解豆粕的各實驗組峰值均大于A組，其中在18h時對IMD mRNA表達量影響最顯著(P<0.05)(表9)。對蝦溶菌酶mRNA表達量最大峰值出現在24h、D組，其中D組和E組峰值均大于A組，飼料中添加酶解豆粕在12h時對溶菌酶mRNA表達量影響最顯著(P<0.05)(表10)。

3 討論

3.1 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦生長性能的影響

研究發現，相對于完整的蛋白質，動物的腸道組織細胞對肽具有更高的吸收效率。經測定，實驗所用酶解豆粕中相對分子量<1000的肽含量占72.83%。通過對蛋白水解產物的研究表明，去除蛋白水解物中的小分子，會降低飼料的利用率，從而發現蛋白水解所產生的小分子復合物對于水生動物的生長至關重要。有研究表明，分子量為1000~3000的水解大豆肽能夠有效促進真鯛(Pagrus major)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生長。本實驗結果顯示，隨著酶解豆粕添加量的增加，雖然對蝦的終末均重和特定增長率都有一定的增長趨勢，飼料系數也有一定程度的降低，但是添加5.5%以內的酶解豆粕對凡納濱對蝦生長性能的改善效果并不顯著，分析原因可能與飼料中小分子肽的總含量較少有部分關系。有研究表明，飼料中大豆多肽添加量低于20%時，對牙鲆幼魚的生長性能和飼料效率并沒有產生顯著的影響。不同餅粕蛋白酶解產物肽的種類和分子組成不同，對異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)產生的營養效果也不同，飼料中小分子肽比例越大，飼養的魚類生產性能表現效果越好。

隨著酶解豆粕添加量的增加，凡納濱對蝦肌肉中粗蛋白含量相較于對照組均有顯著的提高。一方面可能與飼料中普通豆粕含量的降低有部分關系，有研究表明，水生動物的總蛋白水平會隨著飼料中豆粕含量的增加而降低；另一方面可能是酶解豆粕對凡納濱對蝦的蛋白質沉積具有促進作用，相較于大豆蛋白，動物體對大豆肽的吸收更加高效且迅速，減少了動物在吸收過程中的能量消耗，從而促進了動物體內蛋白質的沉積。研究發現，建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)飼料中的魚粉或植物蛋白被等量蛋白肽替代后，可促進魚體粗蛋白質沉積，并降低了內臟重量，優化了建鯉形體指標。而且隨著飼料中豆粕含量的增加，非淀粉多糖對水生動物的影響也會更加明顯。非淀粉多糖在體外和體內均可降低脂肪酶等的活性，影響水生動物對外源脂肪的吸收轉運，而此次實驗中各實驗組粗脂肪含量隨酶解豆粕使用量的增加呈現顯著上升的趨勢，分析原因可能是本實驗所用酶解豆粕是用蛋白酶和非淀粉多糖酶復合酶解，一定程度上降低了豆粕中所含的非淀粉多糖阻礙對蝦對外源脂肪吸收轉運的不利影響。各組對蝦肌肉水分和灰分沒有顯著性差異，說明此次實驗中酶解豆粕并未對肌肉中其他成分產生影響。

酶解豆粕添加量達到4.5%以上時對對蝦的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均有顯著提高，這也與以往的許多研究報道相吻合。豆粕過量替代魚粉會對鯉(Cyprinus carpio)腸道產生損傷同時也會降低肝胰臟蛋白酶的活性。從尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)體內也檢測到，豆粕對消化蛋白酶具有很高的抑制作用。而對蝦對食物的消化吸收能力很大程度上依賴于消化酶的活性。豆粕中胰蛋白酶抑制因子是影響水生動物對大豆蛋白消化吸收的主要抗營養因子，動物體內胰蛋白酶會隨著外部的胰蛋白酶抑制因子的進入反應形成難以被動物體消化吸收的復合物，從而失去應有的活性。通常大豆經酶處理后，消化率會得到相應的改善，這種酶處理方法在魚類攝食前就可引發蛋白質降解。有研究顯示，飼料中大豆水解蛋白替代15%~70%的魚粉時，能夠顯著提高星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚的胰蛋白酶活性。

3.2 飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦抗脅迫機能的影響

機體抗氧化能力是評價水產動物健康狀況的一個重要指標。自由基是一種具有較強氧化作用的物質，當機體應激產生過多自由基時，會氧化組織從而對機體造成損傷。因此機體需要一套健全有效的抗氧化防御體系來調節體內自由基含量，保持機體健康。

蛋白質水解產生的小分子肽，在機體內具有較強的抗氧化活性。研究顯示，酶解大豆蛋白具有較高的還原能力、較高的乳化液抗氧化能力和較強的清除自由基能力，而其抑制β-胡蘿卜素漂白的能力與合成抗氧化劑能力相當，分子量小于10000的酶解大豆蛋白相較于普通大豆蛋白顯示出更高的抗氧化活性。有研究指出，從各種蛋白質水解產物中提取到的生物活性肽，可通過上調抗氧化酶活性，發揮出其潛在的抗氧化作用。飼料中利用大豆蛋白水解物替代魚粉的實驗表明，當替代量達到15%~100%時會顯著增強星斑川鰈幼魚的SOD活性，替代量達到30%~100%時，實驗組MDA含量顯著低于對照組。本實驗結果顯示，低魚粉飼料中酶解豆粕含量對凡納濱對蝦血清溶菌酶、T-SOD活性和MDA含量具有顯著影響。已有研究表明，利用食品級豬胰腺蛋白水解制劑(CorolasePP)酶解大豆粕，通過ABTS和ORAC方法檢測大豆肽水解物的抗氧化活性，結果顯示酶解大豆得到的大豆肽具有較高的抗氧化活性。在飼料中添加水解蛋白產物，會促使牙鲆體內溶菌酶和SOD活性顯著增加。酶解大豆蛋白得到的大豆多肽可提高對動物機體內自由基的清除能力，在調節機體免疫功能、抗氧化和促進礦物元素吸收等方面也發揮著重要作用。相較于普通大豆蛋白，大豆肽增加了清除自由基能力，提高了機體總抗氧化活性和還原能力。

凡納濱對蝦的免疫機能主要是依靠非特異性免疫起作用，而活體攻毒是指在一定劑量致病菌的攻擊下直觀反映機體綜合免疫機能的實驗手段。通過研究副溶血性弧菌對凡納濱對蝦生理生化指標的影響表明，副溶血性弧菌的感染會破壞蝦體的免疫系統，導致免疫機能損壞。有研究表明，在飼料中添加5%~15%的水解蛋白，對花鱸(Lateolabrax japonicus)的非特異性免疫反應有所改善。在低魚粉飼料中添加蛋白水解物飼喂牙鲆幼魚的實驗中發現，飼料中添加蛋白水解產物能提高魚體的先天免疫能力。本實驗結果顯示，隨著感染時間的增加，飼料中添加酶解豆粕對凡納濱對蝦免疫力的改善效果明顯，對照組在各時間點累積死亡率均比其他實驗組同期累積死亡率高。已有研究報道，在大豆水解物中可分離鑒定出抗菌肽，其對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血性弧菌的生長有抑制作用，可提高對蝦的存活率。通過同源序列比對發現，大豆肽中含有一種能夠刺激巨噬細胞和多核白細胞吞噬作用的物質，通過刺激細胞吞噬作用，提高動物機體的免疫力。

營養控制是調節非特異性免疫反應并提高抗病性的有效方法。Toll受體在介導蝦體啟動天然免疫并釋放免疫因子的機制中起著關鍵作用。當對蝦受病原菌入侵時，Toll受體將異物入侵的信號從胞外傳遞到胞內，并引起胞內信號級聯反應，介導細胞啟動先天免疫反應。IMD通路是一個重要免疫識別信號傳導通路，革蘭氏陰性細菌和桿狀陽性細菌能通過跨膜蛋白PGRP-LC激活IMD信號途徑并誘導細胞產生免疫效應因子。溶菌酶作為機體非特異性免疫級聯反應的終端效應因子，除了能溶解細菌細胞壁外，溶解細胞壁時釋放的肽聚糖片段還能誘導各種抗菌蛋白包括溶菌酶的合成與分泌。對蝦進行弧菌實驗時，機體免疫基因表達水平均升高，Toll受體mRNA的表達水平在一定程度上可以反映對蝦對入侵病原識別的靈敏性，而機體清除異物后恢復至正常狀態的過程，在一定程度上反映了機體的免疫平衡性，提高機體免疫的靈敏性和平衡性是提高機體免疫力的根本途徑。此次實驗結果顯示，對照組Toll受體mRNA表達量峰值出現時間最晚，一定程度上可以反映飼料中添加酶解豆粕有助于提高凡納濱對蝦對入侵病原識別的靈敏性。各基因表達量最大峰值均出現在添加酶解豆粕的實驗組，表明酶解豆粕對凡納濱對蝦免疫基因應答具有明顯的促進效果。目前的研究表明，營養水平會在一定程度上影響機體免疫的效果，同時免疫的效果也決定著機體對營養素的需求。蛋白質水平、維生素水平、微量元素水平、飼料能量水平及免疫多糖等均會影響對蝦的免疫機能和抗菌能力。有報道顯示，飼料中混合褐藻多糖喂食斑節對蝦(Penaeus monodon)15d后，可顯著提高斑節對蝦對白斑綜合征病毒(WSSV)的抗病能力。飼料中添加富含核苷酸的酵母提取物使日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)淋巴器官中溶菌酶基因表達量升高，并增強其抗菌能力。研究表明，中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)飼料中添加2%VC能上調鰓組織中Toll受體和NF-κB這2個免疫基因的表達量，適量的VC能提高中國明對蝦的免疫應答能力。

4 結論

綜上所述，含10%魚粉的飼料中，酶解豆粕添加量在5.5%以內對凡納濱對蝦生長性能的改善效果不顯著。添加量達到5.5%時對凡納濱對蝦肌肉中粗蛋白和粗脂肪的改善效果最好。添加量達到4.5%時對凡納濱對蝦消化酶活性、對蝦機體抗氧化能力和抗弧菌感染能力的改善效果最好。

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