菜籽粕是油菜籽經(jīng)預(yù)壓浸出工藝處理后得到的副產(chǎn)物，含蛋白質(zhì)、粗纖維較豐富，目前菜籽粕經(jīng)脫毒處理后是制作牲畜與家禽飼料的主要原料，還可以用于制作食品、化妝品和抗菌素原料。飼用復(fù)合酶是一種飼料添加劑，它的主要成分包括蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等。飼用復(fù)合酶能有效分解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其能被充分消化吸收，提高飼料的利用率，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)菜籽粕研究報(bào)道較多，主要集中在脫毒、滅菌條件、以及作為飼料組分等方面，對(duì)菜籽粕的綜合利用報(bào)道較少。本課題利用混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，并對(duì)其培養(yǎng)基優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分及配比進(jìn)行研究，確定最佳培養(yǎng)基配方。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)一步提高復(fù)合酶產(chǎn)量，對(duì)降低其生產(chǎn)成本，提高其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力有重要意義。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌，毛霉，酵母菌，購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心，由本院生物制藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)訓(xùn)基地保藏。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖：2%，瓊脂：2%；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏：0.3%，蛋白胨：1%，Na-Cl：0.5%，瓊脂：2%。

CBV-1500A超凈工作臺(tái)（上海瑞仰凈化裝備有限公司）；

HH.SYH-Ni2-C水浴鍋（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；

QYC.2102恒溫培養(yǎng)搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；

HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠）；

UV-9100紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽粕的預(yù)處理

利用乙醇法脫毒，脫除有毒物質(zhì)硫甙等物質(zhì)，達(dá)到脫毒目的。

1.2.2 混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

裝50g菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基于250mL搖瓶中，按1∶1∶1比例接入枯草芽孢桿菌、毛霉、酵母菌混合菌種，于溫度為36℃、轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)3d，測(cè)定蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活力，以三酶活力之和作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)復(fù)合酶性能。

1.2.3 蛋白酶活力測(cè)定

按GB/T23527-2009進(jìn)行。酶活力單位定義：在pH7.0、40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。

1.2.4 淀粉酶活力測(cè)定

采用DNS法進(jìn)行測(cè)定。淀粉酶活力單位定義:在pH5.5、50℃條件下，1min分解淀粉釋放出1μg還原糖所需的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。

1.2.5 纖維素酶活力測(cè)定

采用DNS法進(jìn)行測(cè)定。纖維素酶活力單位定義：在50℃條件下，在1min內(nèi)酶解生成1μg還原糖的酶量為1U。

1.2.6 飼用復(fù)合酶總活力

計(jì)算公式如下：

飼用復(fù)合酶總活力=蛋白酶活力+淀粉酶活力+纖維素酶活力

1.2.7 菜籽粕培養(yǎng)基配方優(yōu)化

以脫毒后的菜籽粕為主要原料，選擇不同的無機(jī)鹽（氯化鈣、氯化銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳）和表面活性劑（吐溫-80）為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究各因素對(duì)飼用復(fù)合酶的影響。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的氯化鈣，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的氯化銨，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%的磷酸氫二鉀，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的硫酸鎂，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床培養(yǎng)3d。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的硫酸錳，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床培養(yǎng)3d。

取5個(gè)250mL搖瓶，裝入50g脫毒后的菜籽粕，并分別添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的吐溫-80，按5%比例接入混合菌種，置于溫度36℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d。

2.結(jié)果與分析

2.1 氯化鈣對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

按實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)所得氯化鈣對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響如表1。從表1可知，氯化鈣對(duì)飼用復(fù)合酶活力有明顯的激活作用，在0.05%～0.25%的考察范圍內(nèi)，飼用復(fù)合酶活力與氯化鈣添加量呈正相關(guān)，當(dāng)氯化鈣添加量為0.1%時(shí)，飼用復(fù)合酶總活力達(dá)到5496U/g，繼續(xù)增加氯化鈣添加量，總酶活增加不明顯。綜合考慮，氯化鈣最佳添加量為0.1%。

2.2 氯化銨對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

氯化銨對(duì)飼用復(fù)合酶活力影響見表2。從表2可知，氯化銨對(duì)飼用復(fù)合酶活力影響呈“鐘罩形”，當(dāng)氯化銨添加量為1.5%時(shí)，飼用復(fù)合酶總活力達(dá)到最大值4673 U/g，再增加氯化銨的量，酶活反而下降。其原因是氯化銨在培養(yǎng)基中主要是充當(dāng)?shù)?，?dāng)其含量過量時(shí)，會(huì)影響培養(yǎng)基的C/N比，反而不利于發(fā)酵。因此，最佳氯化銨添加量應(yīng)為1.5%。

2.3 磷酸氫二鉀對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

磷酸氫二鉀對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響如圖1所示。

圖1磷酸氫二鉀對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響從圖1可知，磷酸氫二鉀對(duì)飼用復(fù)合酶活力有明顯的促進(jìn)作用，在1%～3%考察范圍內(nèi)，當(dāng)磷酸氫二鉀添加量為2%，飼用復(fù)合酶總酶活為5124U/g。因此，磷酸氫二鉀最佳添加量為2%。

2.4 硫酸鎂對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

硫酸鎂對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響如圖2所示。從圖2可知，當(dāng)硫酸鎂添加量為0.2%時(shí)，飼用復(fù)合酶總活為5269U/g。其原因是Mg2+對(duì)蛋白酶、淀粉酶均有一定激活作用。因此，硫酸鎂最佳添加量為0.2%。

2.5 硫酸錳對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

硫酸錳對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響如圖3所示，圖中顯示當(dāng)硫酸錳添加量為0.5%時(shí)，飼用復(fù)合酶總酶活達(dá)到5869U/g。因此，硫酸錳最佳添加量為0.5%。

2.6 吐溫-80對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響

吐溫-80對(duì)飼用復(fù)合酶活力的影響如圖4所示，從圖可以，吐溫-80在一定范圍內(nèi)能提高酶活力，但其添加量超過1%時(shí)，酶活反而下降。吐溫-80是一種表面活性劑，它可以提高細(xì)胞的通透性，從而促進(jìn)酶的釋放，但當(dāng)其添加量過高時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)而不利于產(chǎn)物的積累。因此，吐溫-80最佳添加量為1%。

3.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素法研究了混菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)飼用復(fù)合酶的培養(yǎng)基條件。確定了最佳發(fā)酵條件為，以脫毒菜籽粕為原料，添加0.1% CaCl2、1.5% NH4Cl、2% K2HPO4、0.2% MgSO4、0.5%MnSO4以及1% Tween-80。在該條件下飼用復(fù)合總酶活達(dá)到5994U/g，提高了飼用復(fù)合酶產(chǎn)量，對(duì)飼用復(fù)合酶生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

實(shí)戰(zhàn)操作技術(shù)——棉菜籽餅脫毒變身優(yōu)質(zhì)飼料替代豆粕操作新技術(shù)

當(dāng)前豆粕價(jià)格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價(jià)格相對(duì)便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘?jiān)?，蛋白質(zhì)含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質(zhì)，這些物質(zhì)含有一定的毒性，還會(huì)影響動(dòng)物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動(dòng)物！

現(xiàn)在通過微生物飼料發(fā)酵劑的除毒脫毒技術(shù)，可以成功將菜籽餅變?yōu)閮?yōu)質(zhì)添加飼料，直接按照1公斤發(fā)酵的棉菜籽餅（發(fā)酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進(jìn)行使用。飼料發(fā)酵劑中的有益微生物，在發(fā)酵過程中分泌的代謝產(chǎn)物，可將棉菜籽餅中的毒性物質(zhì)等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對(duì)比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質(zhì)含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點(diǎn)是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質(zhì)中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質(zhì)含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質(zhì)含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質(zhì)含量36.04%。精氨酸含量高達(dá)3.6%-3.8%，而賴氨酸含量?jī)H有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日?qǐng)?bào)價(jià)每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經(jīng)過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸，在不需要額外加入動(dòng)物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進(jìn)它們的營(yíng)養(yǎng)吸收。只有當(dāng)其他粕類單位蛋白成本遠(yuǎn)低于豆粕時(shí)，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經(jīng)過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產(chǎn)生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質(zhì)。這些物質(zhì)可引起甲狀腺腫大，從而造成動(dòng)物生長(zhǎng)速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質(zhì)的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長(zhǎng)受到抑制。。使用前需進(jìn)行一定的脫毒處理，并且使用時(shí)要加以限制，具體喂量應(yīng)根據(jù)菜粕中有害成分含量而定。經(jīng)過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產(chǎn)的菜粕喂量要受限制。同時(shí)，應(yīng)結(jié)合菜粕的氨基酸組成特點(diǎn)，適當(dāng)搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對(duì)動(dòng)物有害的棉酚及環(huán)丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合而變成結(jié)合棉酚，結(jié)合棉酚在動(dòng)物消化道內(nèi)不被動(dòng)物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對(duì)動(dòng)物毒性較大，尤其單胃動(dòng)物過量攝取或攝取時(shí)間較長(zhǎng)，可導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、繁殖性能及生產(chǎn)性能下降，甚至導(dǎo)致死亡。幼小動(dòng)物對(duì)棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對(duì)動(dòng)物有害，因此，在使用棉餅、粕時(shí)，要根據(jù)飼喂對(duì)象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優(yōu)質(zhì)粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會(huì)造成中毒。對(duì)單胃動(dòng)物要限制喂量，最好使用經(jīng)過脫毒處理的棉籽餅粕。同時(shí)，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應(yīng)注意添加賴氨酸。

發(fā)酵操作技術(shù)

發(fā)酵棉菜籽餅其實(shí)也是一個(gè)脫毒技術(shù)，具體操作如下：

1.仔細(xì)檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴(yán)重變質(zhì)發(fā)霉的部分，輕度發(fā)霉的原料可以忽略，因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調(diào)節(jié)飼料營(yíng)養(yǎng)比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發(fā)酵劑”1包（500g/包，市場(chǎng)售價(jià)約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復(fù)合酶制劑的專業(yè)發(fā)酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發(fā)酵方式根據(jù)實(shí)際環(huán)境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發(fā)酵均可。

6.發(fā)酵時(shí)要盡可能排盡空氣進(jìn)行密封發(fā)酵。如果使用的發(fā)酵容器有密封不嚴(yán)實(shí)的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發(fā)酵過程中不能啟封。

7.發(fā)酵時(shí)間受環(huán)境溫度影響，通常夏季發(fā)酵2-3天，冬季發(fā)酵5-7天即可完成。發(fā)酵完成后，有較為強(qiáng)烈的酸香味，ph值在3-4。

規(guī)模運(yùn)用混合發(fā)酵現(xiàn)場(chǎng)

塑料缸、飼料袋（有內(nèi)膜）均可做發(fā)酵飼料

采用池子發(fā)酵

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動(dòng)物技術(shù)

需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時(shí)根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動(dòng)物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時(shí)，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長(zhǎng)時(shí)間保存（一年左右）。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價(jià)原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價(jià)收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時(shí)發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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