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導讀

    隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 畜禽氮排放造成的環(huán)境污染問題日趨嚴重。每年我國畜禽總氮排放量約為3000萬t, 其中單胃動物 (主要是豬) 的氮排放量約占57%。大量研究表明, 在生產(chǎn)中通過使用合成氨基酸配制低蛋白質(zhì)飼糧可以有效地降低蛋白質(zhì)飼料的使用, 同時能夠顯著地減少畜禽排泄物中氮污染物的含量, 極大程度地改善畜禽養(yǎng)殖造成的環(huán)境污染問題。

    本課題組前期研究發(fā)現(xiàn), 在低蛋白質(zhì)飼糧中添加支鏈氨基酸 (BCAA) 可以顯著降低氮排放, 提高飼糧氮利用效率;在低蛋白質(zhì)飼糧中添加0.27%纈氨酸或者0.4%亮氨酸均顯著降低尿氮損失, 同時亮氨酸的添加能夠促進蛋白質(zhì)沉積, 顯著改善胴體品質(zhì)。亮氨酸是一種極為重要的支鏈氨基酸, 其在動物機體蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著不可替代的作用, 當前國內(nèi)外對于豬低蛋白質(zhì)飼糧中氨基酸添加的研究多局限于賴氨酸、蛋氨酸等, 對于低蛋白質(zhì)水平下生長育肥豬飼糧中亮氨酸的添加水平及添加后對氮平衡的具體影響仍不清楚。因此, 本試驗旨在研究低蛋白質(zhì)飼糧中添加亮氨酸對育肥豬氮平衡的影響, 以期為提高蛋白質(zhì)利用率, 同時降低生產(chǎn)中的氮排放提供科學依據(jù)。

1.1 試驗飼糧

    參照NRC (1998) 理想氨基酸模式配制等消化能 (13.93 MJ/kg) 、等賴氨酸含量 (標準回腸可消化賴氨酸為0.75%) 、除亮氨酸外相同氨基酸模式的正常蛋白質(zhì)飼糧 (粗蛋白質(zhì)含量為14.5%) 和4個添加不同水平 (0、0.4%、0.8%和1.2%) 亮氨酸的低蛋白質(zhì)飼糧 (粗蛋白質(zhì)含量為10.0%) 。試驗飼糧營養(yǎng)水平均滿足或高于我國《豬飼養(yǎng)標準》 (NY/T 65—2004) 的推薦值, 試驗飼糧組成見表1, 試驗飼糧營養(yǎng)水平見表2。

1.2 試驗設計

   本試驗選取10頭初始體重為 (70.7±3.1) kg的健康杜×長×大雜交去勢公豬, 根據(jù)體重分為5組, 每組2頭豬, 采用5×5拉丁方設計, 整個試驗期為50 d, 共分為5期, 每期10 d, 前5 d為預試期, 后5 d為收集期。

1.3 飼養(yǎng)管理

     試驗于農(nóng)業(yè)部飼料效價與安全監(jiān)督檢驗測試中心 (北京) 畜禽試驗基地進行, 采用全封閉式豬舍。豬舍溫度、通風強度和濕度自動化控制, 舍溫恒定為26℃。育肥豬單籠飼養(yǎng), 豬籠體積為1.25 m×0.80 m×1.00 m, 漏縫塑料地板, 不銹鋼可調(diào)式料槽, 乳頭式飲水器。每天08:00和16:00各飼喂1次, 試驗開始前5 d為預試期, 估測豬的大致采食量為2.5 kg/d, 每次喂料量相同, 動物采食后自由飲水。按常規(guī)管理程序進行驅(qū)蟲和免疫。

1.4 樣品采集

    在收集期內(nèi)收集糞尿, 糞樣的收集采用全收糞法, 尿樣的收集采用全收尿法, 并記錄每期的飼糧采食量。在收集期內(nèi)準確收集育肥豬所排糞便, 并將糞樣放入-20℃冰箱中保存。在收集期內(nèi)準確收集育肥豬所排尿液, 向盛放尿樣的桶內(nèi)加入適量10%的硫酸 (98%的硫酸與水以體積比1∶9混合) 固氮, 每天準確計量所收集尿樣的體積, 按5%取樣后放入-20℃冰箱中保存。每個收集期結束時, 每只育肥豬空腹前腔靜脈采血10 mL, 3 500 r/min離心10 min, 分離血清, 于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/span>

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 飼糧營養(yǎng)物質(zhì)含量的測定

     飼糧干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣和總磷含量檢測參照AOAC (2000) 的方法。

    飼糧氨基酸含量的檢測:試驗飼糧樣品粉碎后分別在110℃下經(jīng)6 mol/L鹽酸水解24 h和0℃下經(jīng)過甲酸氧化16 h后再經(jīng)鹽酸水解24 h, 用氨基酸自動分析儀 (S7130型, 德國Sykam公司) 測定15種氨基酸和含硫氨基酸含量;用4 mol/L氫氧化鈉在110℃下水解22 h后, 使用高效液相色譜儀 (LC-10A型, 日本島津儀器公司) 測定色氨酸含量。

1.5.2 氮平衡指標的測定

    收集期結束后, 將4 d的糞樣混合、稱重并用四分法取鮮糞樣重的10%于65℃烘箱中烘干, 回潮24 h至恒重, 粉碎并測定糞樣中氮含量。

   收集期結束后, 把4 d所收取的全部尿樣充分混勻, 用于測定尿樣中氮含量。

   糞樣和尿樣中氮含量的測定方法同飼糧中氮含量的測定方法, 根據(jù)育肥豬的日采食量、日排糞量、日排尿量, 計算每日的氮攝入量、氮排出量和氮沉積量, 并計算氮沉積率。

氮沉積率 (%) =100×氮沉積量/氮攝入量。

1.5.3 氨基酸全腸道表觀消化率的測定

    凍干糞樣中氨基酸含量的測定方法同飼糧中氨基酸含量的測定方法, 根據(jù)育肥豬的日采食量和日排糞量, 計算氨基酸全腸道表觀消化率, 公式如下:

氨基酸全腸道表觀消化率( %) = 100×( 氨基酸攝入量－糞中氨基酸含量) /氨基酸攝入量。

1.5.4 血清尿素氮濃度的測定

    采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定血清尿素氮濃度。

2.1 低蛋白質(zhì)飼糧中添加不同水平亮氨酸對育肥豬氮平衡和血清尿素氮濃度的影響

    從表3中可以看出, 在粗蛋白質(zhì)含量為10.0%的低蛋白質(zhì)飼糧中添加低于1.2%的亮氨酸時對育肥豬的干物質(zhì)采食量無顯著影響 (P>0.05) 。從氮平衡的數(shù)據(jù)可以看出, 4個低蛋白質(zhì)飼糧組中育肥豬氮攝入量顯著低于正常蛋白質(zhì)飼糧組 (P<0.05) , 繼而氮排出量和氮沉積量也顯著低于正常蛋白質(zhì)飼糧組 (P<0.05) , 但是氮沉積率顯著高于正常蛋白質(zhì)飼糧組 (P<0.05) 。與未添加亮氨酸的低蛋白質(zhì)飼糧相比, 在粗蛋白質(zhì)含量為10.0%的低蛋白質(zhì)飼糧中添加少量 (0.4%) 的亮氨酸時, 氮排出量顯著降低 (P<0.05) , 氮沉積量和氮沉積率出現(xiàn)顯著升高 (P<0.05) ;而當亮氨酸添加水平繼續(xù)增加時, 氮沉積量和氮沉積率又會出現(xiàn)顯著的下降 (P<0.05) 。

3.1 低蛋白質(zhì)飼糧中添加不同水平亮氨酸對育肥豬氮平衡和血清尿素氮濃度的影響

     氮是畜牧生產(chǎn)中造成環(huán)境污染的主要物質(zhì)之一, 近年來, 國內(nèi)外對于低蛋白質(zhì)飼糧對生長肥育豬氮排泄影響的研究較多。對于生長育肥豬而言, 飼糧中63%的氮通過糞和尿排出體外, 既造成了氮的浪費又污染了環(huán)境。大量研究表明, 在不影響生長性能的前提下, 生長肥育豬飼糧蛋白質(zhì)水平每降低1%, 豬氮排出量可減少8%～10%。Canh等發(fā)現(xiàn), 將飼糧蛋白質(zhì)水平降低2%～4%, 并添加賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸之后, 55 kg的生長育肥豬糞氮排出量并未減少, 但尿氮排出量顯著下降, 飼糧蛋白質(zhì)水平每降低1%, 糞尿釋放出的氨氣會減少10.0%～12.5%。在本試驗中, 粗蛋白質(zhì)含量為10.0%的低蛋白質(zhì)飼糧組的氮排出量比粗蛋白質(zhì)含量為14.5%的正常蛋白質(zhì)飼糧組低12.62%, 該結果與上述相關研究結果相一致, 說明降低飼糧中的蛋白質(zhì)水平能減少氮排出, 減少養(yǎng)豬生產(chǎn)中氮的浪費, 緩解氮排放造成的環(huán)境污染。此外, 眾多研究發(fā)現(xiàn), 飼糧蛋白質(zhì)水平降低時, 血漿尿素氮濃度隨之呈線性降低。本試驗顯示, 低蛋白質(zhì)飼糧組與正常蛋白質(zhì)飼糧組相比, 育肥豬血漿尿素氮濃度出現(xiàn)顯著降低, 此結果進一步印證了飼糧蛋白質(zhì)水平降低會降低氮排放。

    大部分氮損失與氮源的消化利用率低有關, 因而提高飼糧中蛋白質(zhì)的利用效率非常重要。Rotz的研究表明, 在低蛋白質(zhì)飼糧添加合成氨基酸, 能夠通過改善氨基酸的平衡, 提高育肥豬的氮利用率, 顯著提升氮沉積率, 有效減少氮的損失。此外, 有試驗證明, 低蛋白質(zhì)飼糧中添加支鏈氨基酸 (亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸) 能顯著改善斷奶仔豬的生長性能和氮利用效率。故而, 本試驗進一步研究了在低蛋白質(zhì)飼糧中添加不同水平度亮氨酸對育肥豬氮平衡的影響。

    已有研究表明, 在飼糧中添加過量 (3.12%) 的亮氨酸或α-酮戊己酸 (亮氨酸的轉氨產(chǎn)物) 會顯著影響斷奶仔豬的平均日采食量, 同時顯著降低平均日增重, 對斷奶仔豬的生長產(chǎn)生有負面影響。因此, 在正式試驗開始之前, 本研究通過預試驗研究了低蛋白質(zhì)飼糧中添加不同水平亮氨酸對育肥豬采食量的影響, 結果顯示, 當亮氨酸添加水平高達1.8%和2.5%時會顯著降低育肥豬的采食量, 故而正式試驗時設定的低蛋白質(zhì)飼糧中亮氨酸添加水平低于1.8%。正式試驗所得結果與前人研究相一致, 即0.4%～1.2%的亮氨酸均未對育肥豬的采食量產(chǎn)生不良影響。

    亮氨酸作為蛋白質(zhì)合成的重要底物, 無法在哺乳動物體內(nèi)合成。大量研究表明, 亮氨酸能夠有效地促進蛋白質(zhì)合成, 抑制蛋白質(zhì)降解。Sugaw ara等研究發(fā)現(xiàn)在低蛋白質(zhì)飼糧中添加亮氨酸能夠緩解低蛋白質(zhì)飼糧引發(fā)的蛋白質(zhì)降解。近年的研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸可以通過增強哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1 (mTORC1) 及活化其下游效應物來刺激新生仔豬肌肉蛋白質(zhì)的合成。故而, 本試驗在應用粗蛋白質(zhì)含量為10.0%的低蛋白質(zhì)飼糧的基礎上添加了不同水平的亮氨酸, 結果表明亮氨酸的添加顯著提高了氮沉積率, 其中0.4%亮氨酸添加組效果最為顯著, 氮排出量較粗蛋白質(zhì)含量為14.5%的正常蛋白質(zhì)飼糧組低14.59%, 而氮沉積率則高出12.62%。出現(xiàn)該結果可能是由于支鏈氨基酸在低蛋白質(zhì)飼糧中的添加進一步平衡了低蛋白質(zhì)飼糧的氨基酸平衡性, 從而實現(xiàn)了對氮利用率的提升;同時, 也可能是由于亮氨酸促進了育肥豬肌肉及內(nèi)臟組織的蛋白質(zhì)合成速率, 從而提高了機體對氮的利用效率。而當亮氨酸添加水平超過0.4%時, 氮排出量反而有增高趨勢, 同時氮沉積量顯著減少, 氮沉積率顯著降低, 這可能是亮氨酸添加過量打破了原有的氨基酸平衡, 影響了其他氨基酸的吸收和代謝, 繼而影響了整體氮代謝。

    以氮沉積量為效應指標的二次擬合曲線表明, 隨著飼糧中標準回腸可消化亮氨酸與賴氨酸比值的提高, 氮沉積量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢, 同時, 二次回歸方程評估生長育肥豬飼糧中適宜的標準回腸可消化亮氨酸與賴氨酸比值為1.65, 與0.4%亮氨酸添加組最為接近。目前關于亮氨酸最適添加水平的研究主要集中在仔豬和生長豬階段, 對育肥豬的研究相對較少。Soumeh等研究發(fā)現(xiàn), 在8～12 kg仔豬低蛋白質(zhì)飼糧中添加亮氨酸使標準回腸可消化亮氨酸與賴氨酸比值約為0.93時, 促生長效果最優(yōu);而Wessels等在35 kg生長豬的研究中則發(fā)現(xiàn), 低蛋白質(zhì)飼糧中標準回腸可消化亮氨酸與賴氨酸比值為1.08時生長性能最佳。本試驗主要研究了亮氨酸對育肥豬氮沉積的影響, 結果發(fā)現(xiàn)在低蛋白質(zhì)飼糧中添加0.4%的亮氨酸使標準回腸可消化亮氨酸與賴氨酸比值為1.65時, 氮沉積效果最佳。對于育肥豬而言, 生長性能的改變已經(jīng)很難顯著, 生產(chǎn)上的性能優(yōu)勢偏重于胴體組成, 期望通過添加亮氨酸達到提高氮沉積、改善胴體組成的效果, 有關在低蛋白質(zhì)飼糧中添加亮氨酸對于機體蛋白質(zhì)合成及胴體組成的影響還需要進行進一步的研究。

3.2 低蛋白質(zhì)飼糧中添加不同水平亮氨酸對育肥豬氨基酸全腸道表觀消化率的影響

     氨基酸全腸道表觀消化率的結果顯示, 隨著亮氨酸添加水平的升高, 異亮氨酸和纈氨酸全腸道表觀消化率均出現(xiàn)了線性下降的趨勢。與未添加亮氨酸組相比, 1.2%賴氨酸添加組異亮氨酸和纈氨酸全腸道表觀消化率分別下降1.05%和1.50%。前人的試驗證明, 在飼糧中補充亮氨酸會對血清中異亮氨酸和纈氨酸的濃度產(chǎn)生影響。

    亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸同屬于支鏈氨基酸, 支鏈氨基酸是動物體自身不能合成而必須從飼糧中攝取的必需氨基酸。支鏈氨基酸在動物體內(nèi)具有特殊的代謝途徑, 因而在動物營養(yǎng)中發(fā)揮著重要而獨特的生物學功能。諸多研究已證明這3種支鏈氨基酸之間存在一定的拮抗作用, 即當飼糧中任意一種支鏈氨基酸的含量過高, 將影響其他2種支鏈氨基酸的正常代謝。CervantesRamírez等報道, 在仔豬飼糧中添加0.50%的亮氨酸會顯著降低仔豬血清中異亮氨酸的含量。而王彬等的研究也發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬采食添加中 (0.27%) 和高水平 (0.55%) 亮氨酸的低蛋白質(zhì)飼糧 (粗蛋白質(zhì)含量為16.90%) 3 h后, 血漿中纈氨酸和異亮氨酸的含量顯著降低, 這與本試驗結論一致, 表明當飼糧中添加的亮氨酸超過適宜水平時, 會表現(xiàn)出支鏈氨基酸之間的拮抗作用, 影響機體對于異亮氨酸和纈氨酸的吸收。究其原因, 可能是由于支鏈氨基酸共用同一類型的降解酶和轉運載體, 其在支鏈氨基酸轉移酶的作用下被初步分解為支鏈-α-酮酸, 隨后進一步脫羧后其代謝物共同參與到三羧酸循環(huán)中, 三者之間存在著反饋抑制的機制, 故而平衡一旦被打破, 其中一種支鏈氨基酸含量的升高必然對剩余2種支鏈氨基酸的代謝造成影響。