飼喂乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肉質的影響

2021-01-06 09:18:51 點擊：

摘要：在凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 幼蝦飼料中添加3株植物乳桿菌[Lactobacillus plantarum YRL45、Lactobacillus plantarum QL、Lactobacillus plantarum KTP(C-2)]和3株副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei M5、Lactobacillus paracasei X12、Lactobacillus paracasei SB27)，采用質構儀TPA模式和氣相色譜法分析喂養后肌肉質構和脂肪酸含量變化，研究乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉品質的影響。結果表明，添加乳酸菌能改善凡納濱對蝦幼蝦肌肉的彈性和咀嚼性，其中植物乳桿菌[YRL45、QL、 KTP(C-2)] 的改善效果最好，將幼蝦肌肉的彈性和咀嚼性分別提高了35.14%和85.71% (P＞0.05)。副干酪乳桿菌 (M5、X12、SB27) 能提高對蝦肌肉持水性并且能顯著降低對蝦肌肉中飽和脂肪酸含量，提高多不飽和脂肪酸含量，其中棕櫚酸、十七烷酸和硬脂酸含量顯著降低，EPA與DHA的含量分別增加了23.22%和34.40%。綜上所述，在飼料中添加植物乳桿菌[YRL45、QL、KTP(C-2)]對凡納濱對蝦幼蝦肌肉彈性和咀嚼性有改善作用，副干酪乳桿菌 (M5、X12、SB27) 能顯著改善凡納濱對蝦幼蝦肌肉的脂肪酸組成。

凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)，又稱南美白對蝦、白對蝦，因其高產量、廣鹽性以及鮮美的肉質與高營養價值被廣泛養殖，是當今世界養殖產量最高的三大優良蝦種之一。自中國科學院海洋研究所1988年首次引進凡納濱對蝦以來，其養殖產量急劇增長，到2017年中國海水養殖凡納濱對蝦產量超過1.08×106t，占海水養殖蝦類的80%，然而隨著對蝦養殖業的日益集約化，其肌肉品質隨之下降。為適應消費者和市場需求，改善凡納濱對蝦肉質風味，提高肌肉不飽和脂肪酸含量，進一步提高凡納濱對蝦的營養價值具有重要意義。凡納濱對蝦肌肉的品質受飼料種類和數量的影響，養殖的凡納濱對蝦肌肉品質主要由飼料的質量決定。研究表明，通過改變飼料中蛋白源、脂肪源等營養成分或添加飼料添加劑對凡納濱對蝦肌肉質構與脂肪酸、膠原蛋白等營養成分有一定的改善作用。近年來，乳酸菌、芽孢桿菌等益生菌作為一種飼料添加劑在凡納濱對蝦養殖中備受關注，但有關其研究大多關注于提高對蝦免疫力、促進生長以及對凡納濱對蝦肌肉中基本營養素含量的調節等方面，關于益生菌對凡納濱對蝦品質影響的研究鮮見報道。目前益生菌在改善動物肌肉品質方面的研究主要集中于雞、鴨、豬等畜禽動物。研究發現，在飼料中添加芽孢桿菌、酪酸梭菌 (Clostridium butyricum) 等益生菌對動物肌肉的咀嚼性、持水性和硬度等質構特性和營養成分（如脂肪酸含量組成）等方面有改善作用。但目前少見益生菌對凡納濱對蝦肌肉質構特性與脂肪酸組成的影響研究。本實驗通過在飼料中添加3株植物乳桿菌[Lactobacillus plantarum YRL45、Lactobacillus plantarum QL、Lactobacillus plantarum KTP(C-2)]和3株副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei M5、Lactobacillus paracasei X12、Lactobacillus paracasei SB27)來飼養凡納濱對蝦幼蝦，從肌肉質構、肌肉基本營養素與脂肪酸組成等方面探索乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肉質的改善作用，為益生菌在凡納濱對蝦養殖中的應用提供理論依據。限公司，南美白對蝦1號料）中混勻，最終乳酸菌濃度為108CFU/g飼料，陽性對照組使用商業EM菌液（河南農富康生物科技有限公司，EM 菌液），最終益生菌濃度為108CFU/g飼料，空白對照組用等量無菌生理鹽水與飼料混合。配制完成的飼料在室溫自然晾干后于4℃密封儲存，飼料每周配制1次。

1 材料與方法

1.1 菌株及其處理

3株植物乳桿菌和3株副干酪乳桿菌由哈爾濱工業大學乳科學與發酵實驗室饋贈。各菌株分別在MRS培養基中于37℃靜置培養20h，接種量為2%，培養后于 4000r/min離心15min，無菌生理鹽水洗滌3次，重懸于無菌生理鹽水中，乳酸菌濃度為109CFU/mL。將3株植物乳桿菌和3株副干酪乳桿菌各自按照1∶1∶1的比例混合后備用。

1.2 含菌飼料制備

將處理好的乳酸菌懸液加入到商業對蝦飼料（天邦股份有限公司，南美白對蝦1號料）中混勻，最終乳酸菌濃度為108CFU/g飼料，陽性對照組使用商業 EM菌液（河南農富康生物科技有限公司，EM 菌液），最終益生菌濃度為108CFU/g飼料，空白對照組用等量無菌生理鹽水與飼料混合。配制完成的飼料在室溫自然晾干后于4℃密封儲存，飼料每周配制1次。

1.3 凡納濱對蝦幼蝦分組與飼養

凡納濱對蝦幼蝦購于威海許家村養殖場。將凡納濱對蝦幼蝦隨機分配于16個50L水族缸中暫養馴化10d，暫養結束后將所有對蝦混合，挑選大小一致的對蝦稱重隨機分組，對蝦均重約為2.13g。正式飼養時，每個50L水族缸中放養20尾對蝦，實驗分為4組，每組3個平行，分別飼喂添加混合植物乳桿菌的飼料（記為P組）、添加混合副干酪乳桿菌的飼料（記為C組）、添加 EM 菌的飼料（陽性對照組，記為E組）和添加無菌生理鹽水的飼料（空白對照組，記為B組）。所有對蝦均飼養于鹽度為24的人工海水中，溫度為(26±1)℃，每日飼喂約對蝦5%體重的基礎飼料，持續通氣，循環水飼養，及時排污換水，飼養28d。飼養結束后將對蝦饑餓處理1d后取樣，凡納濱對蝦幼蝦處死后將肌肉置于自封袋，液氮速凍后運輸至實驗室儲存于 -20℃待用。

1.4 凡納濱對蝦幼蝦肌肉質構與失水率

利用質構儀 (英國 SMS，TA.XT PLUS) 對凡納濱對蝦幼蝦肌肉第2腹節進行 TPA 實驗，測定對蝦肌肉的硬度、彈性、黏附性和咀嚼性。應用 P/5 圓柱形探頭，檢測速率為30mm/min，形變量50%，最小作用力0.75N，每組5個平行。同時取1g左右對蝦肌肉，用雙層濾紙包裹后1000g離心5min，稱重后計算失水率，失水率 =(m0–m1)/m0，m0為初始肌肉重量，m1為離心后肌肉重量，每組3個平行。

1.5 凡納濱對蝦幼蝦肌肉中丙二醛 (MDA) 含量

凡納濱對蝦幼蝦肌肉中丙二醛 (MDA) 含量用南京建成生物工程研究所研發的試劑盒 (TBA法) 測定，每組3個平行。

1.6 凡納濱對蝦幼蝦營養素檢測

凡納濱對蝦幼蝦肌肉水分測定參照 GB 5009.3-2016中直接干燥法；粗灰分測定參照 GB 5009.4-2016中食品中總灰分測定方法；粗蛋白含量參照 GB 5009.5-2016中自動凱氏定氮法。肌肉中總脂肪的含量用氯仿–甲醇法提取后稱重，稱取約1g的肌肉，充分研磨成勻漿，加入20 mL氯仿–甲醇混合液 (比例 2∶1，V/V)制備肌肉勻漿液，漩渦混勻后37℃水浴30 min，8000r/min，離心10min，取上清，將沉淀再次加入20mL氯仿– 甲醇混合液 (比例2∶1，V/V)，重復上述步驟，使得脂肪充分抽提出來，過濾以除去殘渣，濾液于旋轉蒸發儀上蒸發掉溶劑，用石油醚將旋蒸瓶上的油脂充分溶解后倒入已經稱重的離心管中，氮吹吹干溶劑后稱重，計算肌肉中脂肪含量。每組測定3個平行。

1.7 凡納濱對蝦幼蝦肌肉中脂肪酸的組成

將提取到的脂肪直接進行甲酯化，即取10mg樣品，加0.6mL 0.5mol/LNaOH溶液，100℃水浴5min。冷卻后加0.8mL 14%BF3/甲醇溶液，100℃水浴5min后冷卻。加0.4mL正己烷，混勻30s后加2mL飽和食鹽水，震蕩離心后取上層有機溶劑層，進行氣相色譜分析 (Agilent，6890)。每組三個平行。氣相色譜條件:美國Agilen公司HP-INNOWAX石英毛細管柱(19091N-113)，30m×0.320mm×0.25μm；進樣口溫度:250℃；分流式進樣，分流比20∶1；進樣量1μL；柱流速1mL/min；升溫程序:170℃保留5min，以1.5℃/min升至220℃，保留5min；載氣:N2。

1.8 數據處理

實驗數據用SPSS 22.0進行單因素 ANOVA 分析處理，結果表示為平均值±標準差(x±SD)，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉的質構特性與失水率的影響

喂養不同乳酸菌的凡納濱對蝦幼蝦肌肉的彈性、咀嚼性、黏附性和硬度等質構特性結果見圖1。從圖1中得知，這4個肌肉質構性質在不同處理組之間均差異不顯著 (P＞0.05)。對蝦肌肉彈性和咀嚼性從高到低依次為P 組、C 組、E 組和B 組，與空白對照組相比，植物乳桿菌YRL45、QL、KTP(C-2) 的效果最好，其肌肉彈性值提高了35.14%，咀嚼性值提高了85.71%。乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉失水率影響的結果見圖2。從圖2中得知，不同處理組的對蝦肌肉失水率均差異不顯著 (P＞0.05)，其中C組失水率最低，相比較空白對照組，其失水率降低了13.83%。

2.2 乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉中 MDA 含量的影響

乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉中MDA含量的影響結果見圖3。從圖3中得知，4個處理組之間均差異不顯著 (P＞0.05)。B 組凡納濱對蝦肌肉中MDA含量最高，P組次之，C 組和E 組較低。相較B 組，C 組和 E 組對蝦肌肉中MDA含量分別減少41.97%和43.26%。

2.3 乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉營養素的影響

不同處理凡納濱對蝦幼蝦肌肉中基本營養成分結果見表1。從表1中得知，各組之間基本營養成分含量差異不顯著 (P＞0.05)。益生菌處理組的粗脂肪和粗蛋白均有所增加，水分略有減少，粗脂肪和粗蛋白提高最多的是 EM 菌劑組，其次是植物乳桿菌組。而與空白對照組相比較，植物乳桿菌處理組的對蝦肌肉中灰分含量減少，副干酪乳桿菌組與 EM 菌劑組含量提高。

2.4 乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉中主要脂肪酸含量的影響

不同處理組中凡納濱對蝦幼蝦肌肉中主要脂肪酸組成見表2。從表2中得知，共有17種主要脂肪酸，其中飽和脂肪酸7種。C 組飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的29.66%，顯著低于其他3組中飽和脂肪酸相對含量 (P＜0.05)；飽和脂肪酸中以棕櫚酸和硬脂酸為主，分別約占總脂肪酸含量的20%和13%；C 組中棕櫚酸和硬脂酸含量較低，分別為18.03%和9.53%，顯著低于其他3組中的相對含量 (P＜0.05)。另外，C 組中的十七烷酸相對含量也顯著低于其他3組。凡納濱對蝦肌肉中檢測到10種不飽和脂肪酸，其中C 組中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的70.34%，顯著高于其他3組中不飽和脂肪酸的相對含量 (P＜0.05)。4組凡納濱對蝦肌肉中的單不飽和脂肪酸相對含量沒有顯著性差異 (P＞0.05)，C 組中的多不飽和脂肪酸相對含量顯著高于其他3組 (P＜0.05)。乳酸菌處理組的不飽和脂肪酸油酸、亞油酸、EPA和DHA在樣品中相對含量較高，均超過總脂肪酸含量的10%，其中C 組單不飽和脂肪酸油酸含量最低，而多不飽和脂肪酸EPA和DHA相對含量有所提高 (P＞0.05)，分別提高了23.22%和34.40%。

3 討論

水產品的肌肉品質與其經濟價值密切相關，本研究將3株植物乳桿菌 [YRL45、QL和KTP(C-2)]和3株副干酪乳桿菌 (M5、X12和SB27) 分別添加到飼料中對凡納濱對蝦幼蝦干預28d后，評價凡納濱對蝦肌肉品質，發現植物乳桿菌YRL45、QL、KTP(C-2) 分別提高了對蝦肌肉彈性值和咀嚼性值35.14%和85.71% (P＞0.05)。蝦體的彈性可以反映對蝦肌肉組織的結合狀況，其結合能力越好，彈性越高；彈性和咀嚼性都反映了對蝦肌肉的食用口感，表明植物乳桿菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉品質有改善作用。MDA是脂質過氧化的分解產物，其積累是脂質過氧化的必要指標。水產品的持水性與肌肉組織狀態、品質、風味有關，其汁液流失越多損失的營養越多。副干酪乳桿菌M5、X12、SB27降低了對蝦肌肉失水率與MDA含量，表明副干酪乳桿菌能提高凡納濱對蝦幼蝦肌肉持水性與抗脂過氧化能力，減少MDA在肌肉中的積累量。研究發現，飼料中添加枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 可極顯著降低鯉 (Cyprinus carpio) 肌肉的失水率；飼料中添加合生元能減少豬死后48h肌肉滴水損失和蒸煮損失，減少肌肉中MDA含量，這種現象可能與益生菌提高肌肉中抗氧化能力與減少肌肉中MDA積累有關。本研究中幼蝦肌肉持水性的改善可能也與幼蝦肌肉中的MDA含量減少有關，陽性對照組的MDA含量與副干酪乳桿菌組接近，但其肌肉失水率比副干酪乳桿菌組高，說明副干酪乳桿菌對肌肉持水性的改善可能還與其他因素有關，比如蛋白質變化等因素，但其具體機制有待進一步研究。飼喂植物乳桿菌[YRL45、QL、KTP(C-2)]與副干酪乳桿菌 (M5、X12、SB27) 的幼蝦肌肉粗脂肪含量提高 (P＞0.05)，這與國內的其他研究報道一致。研究發現，飼料中添加10%乳酸菌對凡納濱對蝦體成分中脂質含量略微提高，沒有達到顯著影響；飼料中添加1.0g/kg和1.5g/kg芽孢桿菌制劑可以提高凡納濱對蝦肌肉中脂肪含量。但也有研究表明，飼料中添加活凝結芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)降低了凡納濱對蝦肌肉粗脂肪含量；飼料中添加芽孢桿菌可以增加對蝦肌肉中干物質、粗蛋白和灰分的含量，但是對脂肪含量沒有顯著影響。本研究發現，乳酸菌使幼蝦肌肉中水分含量有所減少，而粗蛋白含量增加 (P＞0.05)，表明飼料中添加乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦肌肉營養成分有一定的調節作用，但是對不同營養成分的影響效果與已有研究報道并不完全一致，這可能與所用菌株濃度、喂養方式等因素有關，從而對凡納濱對蝦肌肉營養成分有不同的影響。本研究發現，添加副干酪乳桿菌M5、X12、SB27能顯著降低幼蝦肌肉中的棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸和總飽和脂肪酸含量，提高幼蝦肌肉中不飽和脂肪酸的含量 (P＜0.05)。棕櫚酸能提高血脂，使血液中膽固醇含量升高，多不飽和脂肪酸能增加蒸煮時產生的香味，在某種程度上代表肌肉的多汁性。另外，EPA和DHA等多不飽和脂肪酸在控制心血管疾病、免疫紊亂、生長性能、脂質代謝、神經系統發育、視力和色素沉著等方面具有明顯功效。飼料中添加枯草芽孢桿菌或熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 能增加馬氏沼蝦 (Macrobrachium malcolmsonii) 肌肉中脂質含量和多不飽和脂肪酸含量；飼料中添加酪酸梭菌能增加鴨肉中總多不飽和脂肪酸含量，上述研究與本研究結果一致。本研究發現，副干酪乳桿菌能提高EPA和DHA的含量 (P＞0.05)。益生菌能給宿主提供營養和促進宿主自身消化酶活的表達，對胃腸道消化有改善作用。擬桿菌屬 (Bacteroides) 和梭菌屬 (Clostridium) 通過產生脂肪酸和維生素提供宿主營養，還可通過產生胞外酶和必需生長因子來參與動物消化。某些無脊椎動物的脂質組成受微生物環境的影響，一些魚類腸道微生物菌株已被認為可能是多不飽和脂肪酸的生產者。本研究發現，副干酪乳桿菌可能通過產生相關酶或者營養物質影響對蝦肌肉的吸收，影響對蝦對脂肪酸的去飽和能力，從而影響幼蝦肌肉中脂肪酸的組成，但其具體機制還有待進一步研究。

4 結論

本實驗條件下，植物乳桿菌 YRL45、QL、KTP(C-2) 能夠提高對凡納濱對蝦幼蝦肌肉彈性和咀嚼性，副干酪乳桿菌 M5、X12、SB27能夠提高凡納濱對蝦幼蝦肌肉的持水性。副干酪乳桿菌 (M5、X12、SB27) 能顯著降低肌肉中棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸和總飽和脂肪酸的含量，顯著提高多不飽和脂肪酸的含量。這為乳酸菌在凡納濱對蝦養殖中的應用提供了理論依據和技術支撐。

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