24株雞源丁酸梭菌的分離鑒定及耐藥基因與毒力基因攜帶情況
摘 要: 【目的】旨在對雞源丁酸梭菌進行分離鑒定與安全性評估。【方法】利用厭氧培養方法對源自汶上蘆花雞與SPF雞糞便樣品進行丁酸梭菌的分離與純化，挑選可疑菌落進行微生物質譜鑒定，進一步通過16S rRNA基因測序進行鑒定，16S rRNA測序結果與NCBI核苷酸數據庫中丁酸梭菌的16S rRNA序列進行同源性分析；同時，進行所有分離株對氧氟沙星、頭孢吡肟等9種藥物的藥敏試驗，利用PCR方法進行mefA等23種耐藥基因，基于益生菌安全要求對樣品進行alpha等4種梭菌毒素基因以及typeA等4種肉毒毒素基因的測定?！窘Y果】共分離鑒定了24株丁酸梭菌。24株均對氧氟沙星等7種抗生素表現為敏感，L-1、L-6、L-12僅對新霉素表現為中介，L-19僅對頭孢吡肟表現為中介。全部菌株的mefA等16種耐藥基因結果全部為陰性，sul2、flor、blaTEM3種耐藥基因全部呈陽性，tetC攜帶率為79.2%，cmlA攜帶率為45.8%，blaOXA攜帶率為37.5%，aadB攜帶率為12.5%，qnrA攜帶率為4.2%。PCR結果顯示所有分離菌株的alpha、beta、epsilon、iota等4種梭菌毒素基因攜帶率0%。全部分離菌株均未攜帶typeA、typeB、typeE、typeF4種肉毒毒素基因。【結論】結果表明，從未飼喂抗生素和丁酸梭菌的汶上蘆花雞與SPF雞群中獲得的24株丁酸梭菌分離株達到預期的安全性要求，可作為益生添加菌的篩選參考株。
丁酸梭菌歸屬于梭菌屬，是一種產芽孢，周生鞭毛的革蘭陽性菌，細胞直或稍彎，內生孢子卵圓,偏心或次端生,培養過程中發酵產酸產氣。丁酸梭菌對各種外界條件的抵抗能力強，具有耐酸、耐膽鹽和耐高溫等特性。作為一種常見的人和動物腸道共生細菌，也經常在環境中發現。有文獻指出部分丁酸梭菌會產梭菌毒素或肉毒毒素，且報道多與E型肉毒毒素有關，如：攜帶typeE丁酸梭菌被認為是嬰兒肉毒中毒或早產兒壞死性小腸結腸炎的原因之一。丁酸梭菌是嚴格厭氧菌，已有研究表明丁酸梭菌出現耐氧性并可能與E型肉毒毒素基因有關，非產毒菌株目前在亞洲被用作益生菌，丁酸可增強斷奶仔豬腸屏障功能，在國內2020年起飼料中禁止添加抗生素的大環境下，丁酸梭菌在畜禽生產中作為一種益生菌制劑具有良好的應用前景。依據IsaK等對丁酸梭菌CBM588進行了7毒素基因的安全性評估，以及FAO/WHO 2006年頒布的益生菌評價指南中提出益生菌耐藥譜和對人體的安全的要求，我們對樣品進行了更全面的8種毒力基因的PCR檢測，CBM588在多次安全評估后于2014年獲得歐盟批準作為食品原料。目前國內并未對丁酸梭菌進行毒素基因方面的安全性評估，所以僅以產量與抗逆性作為篩選標準可能會將攜帶毒素基因的菌株誤作為益生添加，造成潛在風險。本研究對山東省汶上蘆花雞場與SPF雞場分得的丁酸梭菌進行了耐藥、梭菌毒素和肉毒毒素基因方面的安全性評價，分析兩家雞場內丁酸梭菌野株的耐藥與毒素基因攜帶情況，為后續優良菌株的篩選打下基礎，旨在保護動物健康。
1材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 樣品來源：汶上蘆花雞的新鮮糞樣24份，來自9月齡公母混養雞群，采用隨機采樣；SPF雞的新鮮糞樣24份，來自231日齡公母混養雞群，采用隨機分樣。兩家種雞飼料中均未添加丁酸梭菌及抗生素，丁酸梭菌A1株為從市場上某飼用菌粉中分離得到的菌株。
1.1.2 主要試劑和儀器：強化梭菌培養基（RCM）；DNA提取試劑盒（TIANGEN生化科技有限公司）；抗生素藥敏片（杭州微生物試劑有限公司）；微生物質譜儀（德國BRUKER）。
1.2 菌株分離
稱取每份采集的糞便樣品5g與生理鹽水1:9比例加入到50mL離心管中配成稀釋液，震蕩混勻，水浴85℃，10min后再次震蕩，取稀釋液1mL與RCM培養液以1:4比例加入至5mL離心管中，37℃厭氧增菌48h，再次水浴85℃，10min，重復1次RCM增菌，以三線法接種于RCM固體培養基，厭氧培養24h。
1.3 菌株鑒定
1.3.1 微生物質譜鑒定：挑選菌落邊緣不規則的疑似菌落進行微生物質譜鑒定，對經微生物質譜儀鑒定結果為丁酸梭菌的菌落進行純化增菌。
1.3.2 16Sr RNA鑒定：提取細菌基因組DNA，16S通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，對DNA進行16S rRNA的PCR擴增，PCR反應體系25μL：MIX12.5μL，ddH2O9.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min，（95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min40s）34×，72℃，5min。對PCR產物進行測序。16SrRNA測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，記錄與分離株比對結果最高的16S序列及其頻次。
1.4 16S rRNA基因同源性分析
采用Megalign軟件的CLUSTALW功能將16S rRNA測序結果與NCBI核苷酸數據中比對頻次高的丁酸梭菌16S序列：KP944151.1（膿，中國北京，2015）、KC195777.1（沼氣污泥，中國，2013）、MK156151.1（海洋沉積，中國，2018）、MK764959.1（中國，2019）HQ830243.1（稻田，新加坡，2011）進行同源性分析。
1.5 藥敏試驗
選用9種對革蘭陽性菌有效的抗生素藥敏片：氧氟沙星、頭孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、紅霉素、萬古霉素、四環素，以無菌棉簽將增菌24h的菌液均勻涂布于RCM固體培養基上，每個20mL培養基上等距離貼三種藥敏紙片，培養基37℃厭氧培養24h后量取抑菌圈直徑，判定參考說明。
1.6 耐藥基因測定
選用不同種類抗生素耐藥基因引物大環內酯類：ermB、mefA、mrsD，多肽類：vanA、vanB、vanC1，四環素類：tetC、tetD、tetE、tetG，磺胺類：sul1、sul2、sul3，酰胺醇類：cmlA、flor，β-內酰胺類：blaPSE、blaTEM、blaSHV、blaOXA，喹諾酮類：qnrS、qnrA、oqxA，氨基糖苷類：aac（3）-Ia、aadB，共24種耐藥基因，進行PCR檢測，以ddH2O為陰性對照。sul1、blaSHV、blaOXA參考文獻，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見表1。
2結果與分析
2.1 菌株的鑒定
2.1.1 微生物質譜儀鑒定：經微生物質譜鑒定結果顯示分離到24株丁酸梭菌（Clostridium butyricum），部分菌株鑒定結果如表4示。
2.1.2 16S rRNA鑒定結果：BLAST結果顯示24株分離株均為丁酸梭菌，其中汶上蘆花雞場分離到21株，SPF雞場分離到3株，統計比對結果最高的NCBI ACCESSION VERSION與頻次如圖5所示。
2.2 菌株的培養特征
對分離到24株丁酸梭菌，汶上蘆花雞源分離株分別標記為：L-1~L-21，SPF雞源分離株分別標記為：S-22~S-24。菌株培養產物有臭味，菌落形態呈不規則，菌落顏色在RCM培養基呈白色到黃白色，表面光滑，部分分離株如圖1所示。
2.3 同源性分析
部分丁酸梭菌菌株與KP944151.1、KC195777.1、HQ30243.1、MK156151.1、MK764959.1同源性分析如圖2所示，結果表明丁酸梭菌在同源性上與地理源沒有明顯相關性。
2.4 藥敏試驗結果
17株汶上蘆花雞場分離得到的丁酸梭菌與3株SPF雞場分得的丁酸梭菌的藥敏試驗中對氧氟沙星、頭孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、紅霉素、萬古霉素、四環素全部表現為敏感。L-1、L-6、L-12僅對新霉素表現為中介，抑菌圈直徑分別為16mm、15mm、16mm，對其他藥物均表現為敏感；L-19僅對頭孢吡肟表現為中介，抑菌圈直徑為16mm，對其他藥物表現為敏感。部分菌株藥敏試驗結果如圖3所示，統計情況如圖4所示。
2.5 耐藥基因結果
PCR結果顯示24株丁酸梭菌均不攜帶ermB、mefA、mrsD、vanA、vanB、vanC1、tetD、tetE、tetG、sul1、sul3、blaPSE、blaSHV、qnrS、oqxA、aac（3）-Ia16種耐藥基因。24株丁酸梭菌全部攜帶有磺胺類的sul2、酰胺醇類的flor以及β-內酰胺類的blaTEM3種耐藥基因；5種耐藥基因結果顯示為不同程度的攜帶，其中tetC有19株呈陽性，攜帶率為79.2%，cmlA有11株呈陽性，攜帶率為45.8%，blaOXA有9株攜帶，攜帶率為37.5%，aadB有3株呈陽性，攜帶率為12.5%，qnrA有1株呈陽性，攜帶率為4.2%，具體陽性株見表6。
2.6 梭菌毒素基因結果
PCR結果顯示，汶上蘆花雞源與SPF雞源的所有24株丁酸梭菌均不攜帶alpha、beta、epsilon、iota4種梭菌毒素基因中的任何一種，而從市場上某飼用菌粉中分離到的丁酸梭菌A1的alpha（α）毒素蛋白基因的PCR結果顯示為陽性，且片段長度符合目的條帶，如圖5所示。A1PCR擴增產物測序后在Genbank中進行BLAST，與α毒素蛋白基因同源性為99.43%。
2.7 肉毒毒素基因結果
PCR結果表明，24株分離得的丁酸梭菌不攜帶typeA、typeB、typeE、typeF4種肉毒毒素基因中的任何一種，typeE PCR結果見圖6。
3討論
本研究從汶上蘆花雞場與SPF雞場分得的丁酸梭菌在RCM固體培養基上呈現為大小不等的白色到黃白色、邊緣不規則菌落，這與目前研究中丁酸梭菌的菌落特征相符。16S rRNA鑒定結果與質譜鑒定結果一致，表明質譜與16S rRNA均可以快速準確地完成丁酸梭菌鑒定。
16S rRNA測序結果表明，SPF雞場的3株丁酸梭菌之間差異較顯著，汶上蘆花雞場的21株丁酸梭菌之間的差異參差不齊，表明即使在同一雞場中，丁酸梭菌也會表現出差異。易至等2020發表的論文中采用比較基因組學的方法，發現宿主源和地理來源與丁酸梭菌的系統進化沒有明顯的相關性；本研究基于16S rRNA序列對丁酸梭菌分離株的同源性分析結果顯示，宿主源和地理來源與丁酸梭菌的系統進化無明顯相關性。二者結果相符。為進行優良菌株篩選提供更多具有個性的選擇。其中，L-17與KP944151.1相似性最高，為96.64%，樊曉璐等研究中丁酸梭菌與CP016332.1的梭菌屬菌株的相似性為100%，廖秀冬分離得丁酸梭菌相似性最高為99%。
本次試驗中丁酸梭菌分離株在耐藥方面差異不大。3株SPF源丁酸梭菌對所有藥物均表現敏感；汶上蘆花雞場中僅4株菌株存在對2種抗生素的中介。易至等研究中受試菌株對萬古霉素表現同樣為敏感，但對四環素表現出了抗性；高文文等研究中：丁酸梭菌對青霉素有抗性，對紅霉素中介，而此次分離得的丁酸梭菌對青霉素G和紅霉素均表現為敏感；在四環素、萬古霉素結果相同為敏感。王騰浩等研究中，丁酸梭菌對新霉素有抗性，對青霉素、紅霉素、氧氟沙星表現為中介，本研究24株丁酸梭菌中，3株汶上蘆花雞源分離株對新霉素表現中介；對青霉素、紅霉素、氧氟沙星表現敏感；在萬古霉素、四環素表現敏感。
KanekoN等人研究結果表明分得的丁酸梭菌對選用的20種抗生素中的17種不具有耐藥性。而FerrarisL等從早產兒糞便分得的丁酸梭菌對萬古霉素與此次試驗結果都表現為敏感，但其表現出青霉素G（15%）、四環素（7.5%）的耐藥。從藥敏試驗結果來看，證實汶上蘆花雞不飼用抗生素，與本研究前期調查結果一致，SPF雞場也一定不使用抗生素。sul2、flor、blaTEM三種耐藥基因在菌株中攜帶率為100%。董睿從雞蛋源分離的沙門菌flor攜帶率為100%，試驗結果與flor耐藥基因目前只發現存在于革蘭陰性菌不符；近些年多種細菌的sul2耐藥基因有較高攜帶率，李晴分離的大腸桿菌耐藥基因中blaTEM攜帶率為100%。5種不同程度攜帶的耐藥基因：tetC、cmlA、blaOXA、aadB、qnrA的來源以及是否會轉移有待研究，易至等就其研究中的四環素抗性結果提出丁酸梭菌可能攜帶有tet耐藥基因，而本研究耐藥基因檢測結果顯示tetC攜帶率為79.2%與其推論基本相符，但本研究中受試菌株對四環素未表現出耐藥。sul2、flor、blaTEM等3種耐藥基因，尤其flor是否能表達并發揮作用還需進一步驗證。目前由于丁酸梭菌作為益生菌的廣泛應用，本研究揭示了，未來丁酸梭菌的篩選與使用上應避免作為其成為耐藥基因的儲存庫，以減少有害菌獲得新耐藥基因的幾率。
本研究分離鑒定的24株丁酸梭菌均未發現攜帶alpha、beta、epsilon、iota等4種梭菌毒素基因，但發現市場上某飼用菌粉中分離得到的菌株A1中攜帶alpha毒素蛋白基因。SulthanaA等在健康人糞便中未分離到攜帶梭菌毒素的丁酸梭菌，IsaK等在對丁酸梭菌標準株CMB588的梭菌內也未發現梭菌毒素基因。梭菌毒素基因的檢測結果初步表明本研究24株丁酸梭菌比市場上的部分產品具有更具安全性。
已有研究表明肉毒毒素基因可通過質粒轉移到梭菌中，目前針對丁酸梭菌攜帶毒素基因的研究也以肉毒毒素基因為主。肉毒毒素基因鑒定結果顯示，本研究24株丁酸梭菌均未攜帶肉毒毒素基因，這與GhoddusiHB等從土壤等多處分離得的93株丁酸梭菌中篩選攜帶E型肉毒毒素基因的研究結果一致（在93個被檢測的分離株中，均未發現typeE的存在）；本研究的24株分離株的肉毒毒素基因攜帶率為0%，表明不會產生typeA、typeB、typeE或typeF肉毒毒素，也進一步驗證了本研究24株丁酸梭菌的安全性。
4結論
結果表明，從未飼喂抗生素和丁酸梭菌的汶上蘆花雞與SPF雞獲得的24株丁酸梭菌分離株達到預期的安全性要求，可作為益生添加菌的篩選參考株。
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