乳桿菌酵母菌及混菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響
摘要：該研究分別用乳桿菌和酵母菌單菌及混菌對(duì)哺乳母豬全價(jià)飼料進(jìn)行固體發(fā)酵，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵飼料pH值、活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，篩選出適宜哺乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳酸桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042，并對(duì)篩選出的乳酸桿菌和酵母菌復(fù)配發(fā)酵進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3:2）復(fù)配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)20.68mg/g。
近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)新型飼料資源越來(lái)越受到人們的重視。通過(guò)微生物發(fā)酵，可使飼料或者飼用原料中含有更多的活性益生菌菌體、各種消化酶及代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物及活性小肽、抑菌物質(zhì)，同時(shí)使飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低，起到促進(jìn)生長(zhǎng)、維持動(dòng)物健康的作用。
常用的微生物發(fā)酵菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內(nèi)的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產(chǎn)性能，同時(shí)，能有效抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，控制仔豬的腹瀉，減少抗生素的使用，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值；酵母菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸（粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%）及多種維生素，同時(shí)含有多種動(dòng)物所需的消化酶（α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等）和其他代謝產(chǎn)物，在提高動(dòng)物的免疫、生長(zhǎng)和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價(jià)格低廉并有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求旺盛，具有很好的應(yīng)用前景；酸溶蛋白即分子質(zhì)量較低的蛋白水解物，包括肽和游離氨基酸，使用酸溶蛋白含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵酶解粕類蛋白質(zhì)品質(zhì)，既可以反映其中抗原蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示該類抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低，表明畜禽生長(zhǎng)必需氨基酸含量增加，發(fā)酵飼料中氨基酸組成在向優(yōu)質(zhì)化方向轉(zhuǎn)化。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵飼料在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用和理論研究較多。但國(guó)內(nèi)外對(duì)發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵菌株類型、生理功能、飼喂效果上，對(duì)影響發(fā)酵飼料品質(zhì)的發(fā)酵方式、生產(chǎn)工藝條件、發(fā)酵眾多代謝物質(zhì)的活性成分分析等研究相對(duì)較少，對(duì)發(fā)酵飼料眾多代謝產(chǎn)物的有效成分缺乏較深入的研究。本試驗(yàn)旨在研究適宜哺乳母豬全價(jià)飼料發(fā)酵的乳桿菌和酵母菌的篩選和復(fù)配發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵飼料pH、活菌數(shù)、總酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影響，為乳桿菌和酵母菌發(fā)酵全價(jià)飼料提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 發(fā)酵基料和菌株
玉米豆粕型配合飼料：山東某飼料有限公司。
6株乳桿菌菌株（BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株（BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042）：由山東某生物工程股份有限公司研究院保存。
1.1.2 培養(yǎng)基
MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.3g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，吐溫-801mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20min。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121℃滅菌20min。
1.1.3 化學(xué)試劑
葡萄糖：山東某藥業(yè)有限公司；
蛋白胨：北京某生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
牛肉膏、酵母膏：天津市某生化試劑有限公司；
硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南某化工有限公司；
檸檬酸銨：上海某有限公司；
乙酸鈉：青島某生物科技有限公司；
吐溫-80、氫氧化鈉：天津某化學(xué)試劑有限公司；
磷酸二氫鉀：天津市某化學(xué)試劑有限公司；
氯化鈉：天津某化工股份有限公司；
LBS瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：青島某有限公司。
所用實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海某科技有限公司；
THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州某實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；
HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：某電器有限公司；
KDN-103F自動(dòng)定氮儀、HYP-1008八孔消化爐：上海某儀器有限公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 酵母菌和乳桿菌發(fā)酵液的制備
將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16h備用；將4℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100mL MRS培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h備用。
1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
（1）乳桿菌的篩選
稱取一定量的基料按料水比1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100g/袋裝袋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24h、48h和72h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)和總酸含量。
（2）酵母菌的篩選
稱取一定量的基料于500mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量50g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24h、48h和72h取樣，測(cè)定活菌數(shù)和粗蛋白含量。
（3）混菌發(fā)酵
將上述篩選得到的乳桿菌和酵母菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌:酵母菌（3∶2），生料發(fā)酵，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，分別于發(fā)酵24h、48h和72h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)、總酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。
1.3.3 測(cè)定方法
pH測(cè)定：取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。
乳桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳桿菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。
總酸含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法測(cè)定。粗蛋白含量：參照國(guó)標(biāo)GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》測(cè)定。
酸溶蛋白含量：參照QB/T 2653—2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品2.00g，加入15%三氯乙酸溶液25mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4000 r/min條件下離心10min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測(cè)定方法。結(jié)果為占粗蛋白的百分含量。
2 結(jié)果與分析
2.1 乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響
乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見(jiàn)表1。
由表1可知，發(fā)酵24h時(shí)除菌株BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中以菌株BLCC2-0015最低；48h和72h時(shí)，各pH值均有所下降，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092較低，菌株BLCC2-0015在發(fā)酵48h時(shí)pH值達(dá)到最低，僅為4.12。各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109CFU/g水平，各取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)均以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48h活菌數(shù)達(dá)到81×108CFU/g。各菌株發(fā)酵料總酸含量均逐漸升高，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組（P＜0.05）。其中以菌株BLCC2-0015發(fā)酵72h時(shí)最高，為24.84mg/g。
綜合考慮，選擇適宜哺乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳桿菌為菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092。
2.2 酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響
酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見(jiàn)表2。
由表2可知，菌株BLCC4-0048在發(fā)酵24 h、48h和72h時(shí)活菌數(shù)均在108CFU/g水平，其余菌株均在109CFU/g水平。24h以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，其次是菌株BLCC4-0042；48h和72h時(shí)均以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，72h時(shí)為53.50×108CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，兩者間差異不顯著（P＞0.05）。由粗蛋白含量來(lái)看，各菌株間差異均不顯著（P＞0.05），其中以菌株BLCC4-0021和菌株BLCC4-0042發(fā)酵時(shí)稍高。綜合考慮，選擇適宜作為發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。
2.3 混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響
利用篩選得到的乳桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042混菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵（乳桿菌/酵母菌為3∶2，接種量2%），發(fā)酵溫度為32℃。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，考察混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可知，R0015+J0021、R0015+J0042發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的pH值均顯著低于R0092+J0021、R0092+J0042厭氧聯(lián)合發(fā)酵（P＜0.05）。各復(fù)配組在各時(shí)間點(diǎn)的乳桿菌活菌數(shù)均在109CFU/g水平，且R0015復(fù)配發(fā)酵時(shí)乳酸桿菌活菌數(shù)較高；24h時(shí)R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵活菌數(shù)顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵時(shí)（P＜0.05）。且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵72h時(shí)酵母菌活菌數(shù)低于接種量。R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵組粗蛋白含量均高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組，其中24h和48h時(shí)差異顯著（P＜0.05）。酸溶蛋白含量和總酸含量結(jié)果一致，R0015+J0021和R0015+J0042復(fù)配發(fā)酵組均顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組（ P＜0.05）；R0015+J0021最高。
綜合考慮，選擇乳桿菌BLCC2-0015與酵母菌BLCC4-0021（3:2）聯(lián)合發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料效果最優(yōu)。發(fā)酵24h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)到20.68 mg/g。
3 結(jié)論
本試驗(yàn)對(duì)菌種庫(kù)保存的性能優(yōu)良的乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料飼料，根據(jù)發(fā)酵后飼料pH值、活菌數(shù)、粗蛋白、酸溶蛋白和總酸等指標(biāo)，篩選出適宜發(fā)酵的乳桿菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，適宜發(fā)酵的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。混菌發(fā)酵時(shí)，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3：2）復(fù)配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)20.68mg/g。
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