凝結芽孢桿菌的研究
益生菌凝結芽孢桿菌是近年來國內外學者的研究熱點。凝結芽孢桿菌具有與乳酸桿菌、雙歧桿菌一樣的調節腸道內菌群平衡、促進營養物質代謝和利用、提高免疫力等保健特性，凝結芽孢桿菌形成的芽孢具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性特點。凝結芽孢桿菌作為新型微生態制劑，在畜牧業、水產養殖業、醫藥、保健和食品行業被廣泛應用。作者在此簡單概述凝結芽孢桿菌的理化性質以及在工業生產、養殖業以及臨床等方面的應用進展。
1凝結芽孢桿菌的理化性質
凝結芽孢桿菌為芽孢桿菌屬革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢，表面無鞭毛，多數菌兩端鈍圓，少數菌為短鏈狀。凝結芽孢桿菌的最適生長pH值為6.6～7.0，最適生長溫度為45～50 ℃，可以分解糖類生成L－乳酸，為同型乳酸發酵菌。凝結芽孢桿菌具有產L-乳酸、生成芽孢、兼性厭氧、耐酸等生理生化特征，經口服進入到腸胃后，具有益生保健特性。產L-乳酸特征，使得腸道中的雙歧桿菌等利用乳酸的有益菌能更好地生長與繁殖。生成芽孢特征，可以更好地恢復胃腸道的微生態平衡，且所產芽孢使得凝結芽孢桿菌能夠耐受胃液的低pH值環境。兼性厭氧特征，使得凝結芽孢桿菌適宜在人體消化系統尤其是腸道等低氧環境下生長。耐酸特征，則保證了凝結芽孢桿菌有85％的概率通過胃液在腸 道存活生長。但是由于凝結芽孢桿菌沒有鞭毛，導致其粘附性較弱，無法在腸道中長期存活。凝結芽孢桿菌在腸道中還會分泌大量有益物質，如淀粉酶、蛋白酶、B族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸和凝固素等，這些物質不僅有利于腸道消化吸收還能抑制有害細菌。特別是凝固素，在60℃、pH值4～8的條件下處理90min仍保持生物活性，且不受淀粉酶、酯酶和有機溶劑的影響。因此，凝結芽孢桿菌對胃腸道炎癥有一定的治療作用。
凝結芽孢桿菌還具有很強的抗逆性，在高溫、高滲和酸性環境下均保持較高的存活率，能有效穿過胃液環境（強酸和消化酶），在腸道生長，并發揮益生作用。但在酸性環境中，凝結芽孢桿菌對熱耐受性下降。
2凝結芽孢桿菌在工業領域的應用
2.1 生產乳酸
乳酸及其衍生物作為重要的有機化工原料和精細化學品被廣泛應用。凝結芽孢桿菌發酵產乳酸具有轉化率高、能耗少等特點，原料價廉、來源廣，所產乳酸具有較高的光學純度。現階段國際上乳酸幾乎全部是通過微生物發酵來生產的。目前，對芽孢桿菌屬細菌的研究主要以自然篩選和傳統誘變選育為主。Yadav等報道了一系列產乳酸菌株，其中便有凝結芽孢桿菌。康莉首先采用高錳酸鉀－溴化鉀平板法初篩出高產乳酸的凝結芽孢桿菌菌株，然后通過紫外－氯化鋰復合誘變進行復篩，為了進一步提高殘留總糖的消耗速率，在發酵過程中又采用光敏試劑８－甲氧補骨脂素對菌株進行誘變處理，使得誘變后的菌株消耗麥芽二糖的能力提高了21.3％，乳酸產量最高達到64.8ｇ·L-１。馬瑞通過單因素實驗和Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ實驗篩選出凝結芽孢桿菌Ｓ44，并對其發酵產L-乳酸條件進行了優化，結果發現，在優化條件下，發酵72ｈ，85ｇ·L-１葡萄糖即消耗完畢，乳酸產量提高了25.2％，由優化前的59.09ｇ·L-１提高到73.95ｇ·L-１，糖酸轉化率為86.75％，糖利用率為100％。謝月嬌用PEG酶水解玉米秸稈中的木質纖維素得到葡萄糖，葡萄糖得率為81.11％，酶解率為87.01％；然 后 利 用 酶 解 上 清 液 進行凝結芽孢桿菌 LA204發酵產乳酸，乳酸最終濃度為84.49ｇ.L-１，秸稈轉化率達到0.56ｇ·ｇ-１，基本實現秸稈纖維素和半纖維素的有效利用。Ong等利用凝結芽孢桿菌 ＷＣＰ10-４發酵纖維二糖產L-乳酸，200ｇ·L-１的纖維二糖以97.8％的轉化率和7.01ｇ·L-１·ｈ-１的產酸速率轉化成了196.3ｇ·L-１的 L-乳酸。
2002年，盧濤等從西藏當雄溫泉附近的土壤中篩選到一株凝結芽孢桿菌，經紫外線和亞硝基胍誘變，獲得一株酶活達到100Ｕ.ｍL-１的突變菌株，較出發菌株的酶活提高了約25倍，發酵液經90 ℃ 處理60min，相對酶活仍保持在90％以上。Badu等對凝結芽孢桿菌發酵產胞外α－淀粉酶的培養條件進行優化，發現有機氮 源（如蛋白胨和牛肉提取物）利于其產生α－淀粉酶。Medda等對凝結芽孢桿菌 ＣＵＭＣ512所產淀粉酶進行純化，比活力提高72倍，酶產率為49％～52％。
2.3 生產脂肪酶
細菌脂肪酶在生物技術工業中發揮著重要作用，如作為洗滌添加劑、催化外消旋化合物動力學分解以及催化酯化反應等。Kanwar等對凝結芽孢桿菌 MTCC-6375的一種新型胞外脂肪酶進行了分離純化，該酶在45℃下暴露20min依然能夠保持100％的酶活。Alkan等通過凝結芽孢桿菌固態發酵制備胞外脂肪酶，以甜瓜固體廢棄物為基本營養源，添加1％橄欖油，培養24ｈ，脂肪酶產量達到最高（78069Ｕ·ｇ-１）。Gowthami等從土壤樣品中分離得到一株能夠分泌耐高溫脂肪酶的凝結芽孢桿菌，優化培養條件后，脂肪酶產量增加3.2倍。
3討 論
近年來我國養豬用抗生素的弊端日益暴露，研發與推廣安全高效飼料已成為飼料工業與養豬業的熱點之一。我國農業部已于2013年12月30日將凝結芽孢桿菌正式列入《飼料添加劑品種名錄 2013》。凝結芽孢桿菌具有乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道主要有益菌的相似益生功能，且具備良好的抗逆性，能夠滿足仔豬等畜禽顆粒飼料的加工需求。蒲俊寧在斷奶仔豬飼糧中添加200~400ｇ·ｔ-１凝結芽孢桿菌制劑，結果發現，仔豬的空腸食糜雙歧桿菌數量、盲腸食糜雙歧桿菌和芽孢桿菌數量顯著增加（P＜0.05），空腸黏膜ｃｌａｕｄｉｎ-１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ基因表達水平明顯 提 高（P＜0.05），空腸黏膜mucin2基因mRNA相對表達量也顯著提高（P＜0.05），斷奶仔豬飼糧中添加苯甲酸＋凝結芽孢桿菌＋牛至油顯著降低了仔豬血清TNF-α和ＩＬ-１β的含量。楊玲等在仔豬飼糧中添加200ｍｇ·ｋｇ-１凝結芽孢桿菌，明顯降低了仔豬腹瀉率及仔豬糞便大腸桿菌數 量。張越 等在斷奶仔豬飼糧中添加凝結芽孢桿菌，然后前腔靜脈采血，分離血漿；屠宰場取腸段制成切片，顯微鏡觀察發現，添加凝結芽孢桿菌可改善仔豬小腸形態結構，顯著提高仔豬血液白蛋白水平，降低總膽固醇和谷氨酰轉肽酶水平，提高回腸和十二指腸絨毛高度，增大十二指腸絨毛表面積。李永明等研究了飼糧添加凝結芽孢桿菌對母豬及仔豬腸道微生物組成和血清生化指標的影響，結果發現，與對照組相比，飼糧添加凝結芽孢桿菌有提高母豬糞微生物多樣性指數的趨勢（P＝0.15），顯著提高 Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ屬細菌含量（P＜0.01），顯著降低Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ屬細菌含量 （P＜0.05），有提高 Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ（P＜0.1）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ（P＝0.1）和Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ（P＜0.1）屬細菌含量的趨勢，有降低 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（P＜0.1）、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ（P＝0.05）、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（P＜0.1）和 Ｐｌａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（P＝0.1）屬細菌含量的趨勢；同時使母豬血清內毒素（ＥＴ）含量顯著降低21.3％（P＜0.05）、血清免疫球蛋白ＩｇＧ 含量顯著提高23.3％（P＜0.05）、血清觸珠蛋白（ＨＰＴ）含量顯著降低50％（P＜0.01）、主要急性期蛋白（ＭＡＰ）含量顯著降低34.5％（P＜0.05），可見飼糧添加凝結芽孢桿菌可明顯減少母豬腸源性內毒素吸收，減少炎癥反應，增強免疫力，提高母豬健康水平。黃遵錫等發現飼用凝結芽孢桿菌制劑能夠顯著增加實驗仔豬體重，顯著降低料肉比。
3.2 水產養殖
隨著科技的進步，人民生活水平的提高，水產養殖規模逐步擴大，從而引發養殖環境惡化、水產疾病頻發等問題，為解決這些問題，大量使用消毒劑和抗生素，形成了惡性循環。微生態制劑具有安全性高、無殘留的特性，有望成為治理水產養殖環境的利器。凝結芽孢桿菌不僅可促進水產動物消化吸收，降低餌料系數，提高免疫和抗病能力，還可凈化養殖環境。付天璽等在基礎飼料中分別添加不同劑量的凝結芽孢桿菌均能顯著提高奧尼羅非魚的胃、肝、胰和腸道蛋白酶活性（P＜0.05），實驗組的干物質表觀消化率、蛋白質消化率、相對增重率、餌料系數和蛋白質效率顯著高于對照組（P＜0.05）。Ring等發現凝結芽孢桿菌能夠促進錦鯉的生長，與對照組相比，實驗組錦鯉體重每尾約增加8.3ｇ，存活率提高2.7％。張維娜采用體外抑菌實驗和共培養實驗考察了凝結芽孢桿菌JSSW-07對多種水產病原菌的拮抗作用，結果發現，凝結芽孢 桿菌對溫和氣單胞菌 （Aeromonas sobria）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）具有拮抗作用，能夠抑制其生長，同時還能夠提高堿性磷酸酶、總蛋白、谷草轉氨酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶的水平，提高肝臟抗氧化能力，從而較好促進銀鯽幼魚的生長，提高機 體 免 疫 力。王彥波研 究 發 現，在 飼料中添加適量凝結芽孢桿菌，能夠改善羅非魚肌肉中鈣、磷和粗脂肪的含量并增強其生長性能。趙鈺以凝結芽孢桿菌LL1103為研究對象，發現粗提抑菌物質lactocinL L1103在各濃度下均能對大黃魚起到抑制腐敗菌生長、延長貨架期的作用。王明陽等發現添加１×1010CFU·kg-１凝結芽孢桿菌，能 顯 著 提 高對蝦血清溶菌酶、總一氧化氮合酶、誘導性一氧化氮合酶的活性，可見飼糧添加凝結芽孢桿菌可有效促進凡納濱對蝦的生長，提高其血清非特異性免疫水平。
國內對凝結芽孢桿菌在養雞方面的應用研究還處于起步階段，相關報道不多。趙必遷等探究了凝結芽孢桿菌對蛋雞生產性能的影響，采用玉米－豆粕型粉狀飼糧，選取24000只315日齡的羅曼粉殼蛋雞，隨機分成3組，2個實驗組在對照組飼糧基礎上分別添加150mg·kg-１和200mg·kg-１凝結芽孢桿菌，結果顯示，2個實驗組產蛋率 顯著提高 2.02％ （P＜0.05）和1.57％（P＜0.05），破蛋率顯著降低17.25％（P＜0.05）和 14.78％（P＜0.05），死亡率顯著降低22.58％（P＜0.05）和29.03％（P＜0.05）。王政等考察了飲水中添加凝結芽孢桿菌對白羽肉雞生產性能、腸道微生物數量、揮發性脂肪酸及空腸腸道形態結構的影響，結果表明，飲水中添加１×106cfu·ｍＬ-１的凝結芽孢桿菌能顯著提高白羽肉 雞采食量 （P＜0.05），盲腸食糜中乳酸桿菌數量顯著增加（P＜0.05），而大腸桿菌數量顯著降低（P＜0.05），高劑量的凝結芽孢桿菌能夠顯著增加丁酸和總揮發性脂肪酸的生成（P＜0.05），并增加空腸絨毛高度／隱窩深度。曹廣軍等研究發現，在商品母黃羽雞基礎飼糧中添加不同劑量的凝結芽孢桿菌制劑可提高日均采食量和日均增重量，顯著降低料肉比，同時提高肌肉的pH值，緩解肌肉酸解速度。Wu等研究發現，凝結芽孢桿菌對患有壞死性腸炎的肉雞有顯著療效。
凝結芽孢桿菌作為一種高耐受性的益生菌，可以順利通過人體胃腸道系統，調節腸道菌群異常所引起的疾病，調節腸道消化功能，作為免疫佐劑提高腸道免疫力。基于凝結芽孢桿菌在宿主腸道中的調節功能，其在胃腸道疾病臨床治療上具有很好的輔助效果。李躍芝用蒙脫石散與凝結芽孢桿菌活菌片聯合沙棘干乳劑治療小兒遷延性腹瀉，效果很好。同樣的，張玉梅等用凝結芽孢桿菌活菌片與復方胃蛋白酶顆粒聯合治療小兒遷延性慢性腹瀉，5d后，以糞便性狀及次數為評判 標 準，治療有效率達到95％以上，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。Majeed等用凝結芽孢桿菌MTCC5856治療腹瀉型腸道易激綜合癥，與對照組的安慰劑相比，90ｄ后服用凝結芽孢桿菌活菌片的患者臨床癥狀顯著改善。孕婦作為特殊群體，臨床用藥往往受到一定的限制。而凝結芽孢桿菌活菌片非常安全，是國家批準的明確寫明孕婦和哺乳期婦女可以使用的益生菌制劑。郭偉男采用常規靜脈補液療法聯合凝結芽孢桿菌活菌片治療妊娠劇吐，７ｄ治療有效率為100％，治愈率提高了近２倍，在提高總體療效、提高尿酮體轉陰率、改善患者惡心嘔吐癥狀等方面均較單純靜脈補液效果更好（P＜0.05）。凝結芽孢桿菌與其它益生菌相比是唯一具有保水作用的益生菌制劑，可起到保水潤腸的作用，有效消除腹脹便秘等。臨床證明，凝結芽孢桿菌在治療孕婦功能性腹脹、預防剖腹產術后胃腸功能紊亂等方面具有顯著的效果。凝結芽孢桿菌除了對腸道疾病有很好的臨床效果外，對一些細菌病毒等傳染類疾病也有很好的臨床應用效果。凝結芽孢桿菌抑菌物質對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌效果，具有廣譜抗菌性。細菌性陰道病（ＢＶ）是世界范圍內最常見的陰道感染疾病，通常使用抗生素治療，但是治療效果不明顯。為了證明凝結芽孢桿菌的輔助治療可以提高抗生素療法的治愈率，Ｓｕｄｈａ等進行了初步研究：選取40個年齡和患病程度一樣的患者，分成２組，對照 組患者只給予標準抗生素治療，實驗組在抗生素的基礎上輔以凝結芽孢桿菌 ＵｎｉｑｕｅＩＳ-２膠囊，治療90ｄ后，實驗組80％的患者病癥減輕，胺檢測實驗顯示出明顯的陽性反應，而對照組僅45％的患者病癥減輕。手足口病是一種腸道病毒傳染性疾病，多發于學齡前兒童。熱毒寧注射液聯合凝結芽孢桿菌活菌片治療手足口病具有很好的治愈率和總有效率。鄧星梅等用熱毒寧注射液聯合凝結芽孢桿菌活菌片治療手足口病，７ｄ治療總有效率（治愈率和好轉率）為95.24％，治愈率提高了近１倍。
普通凝結芽孢桿菌的耐受性較差，為保證微生態制劑長期儲存不易失活，制備時必須要考慮熱穩定性、耐酸性、耐膽鹽性等一系列問題。為了更好地發揮凝結芽孢桿菌的益生作用，有必要對其產孢條件進行研究。快速大量地形成芽孢是制備凝結芽孢桿菌制劑的關鍵。Sen等采用響應面法對發酵過程進行建模、優化和分析，將凝結芽孢桿菌芽孢形成率提高至87.93％。Das等通過多變量響應面建模和基于遺傳算法的優化，每克生物量芽孢數量達到６×1012 個。陳秋紅等在15Ｌ自動發酵罐中擴大培養凝結芽孢桿菌，控制溶氧30％以上，培養20ｈ，芽孢數量達到5.8×108 CFU·ｍＬ-１，芽孢形成率96.7％。黃曉雪等發現，以紗布屑為固體載體對凝結芽孢桿菌產芽孢有促進作用。楊立華發現西紅柿汁有顯著的促孢作用。戚薇等利用中空纖維超濾裝置高密度培養凝結芽孢桿菌TQ33，菌濃和芽孢數量分別達到1.6×1010 CFU·ｍＬ-１和1.2×1010 CFU·ｍＬ-１，是分批培養的21倍和37倍。另外，無機鹽在調控芽孢形成中也發揮著重要作用； Mn2+能促進芽孢的形成。
4結 論
凝結芽孢桿菌因益生作用和高抗逆特性，已經受到廣泛關注，開發了越來越多的凝結芽孢桿菌保健品和制劑。相信，在不久的將來，凝結芽孢桿菌保健品和藥品能夠更好地惠及人們，保障人們的健康。
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