兩階段調控優化保加利亞乳桿菌合成γ-氨基丁酸
摘要：保加利亞乳桿菌ATCC 11842是制備富含γ-氨基丁酸（GABA）發酵飼料的優良益生菌。菌株生長的最佳初始pH為6.0，最佳溫度為35℃。GABA生物合成的最佳pH為8.0，最佳溫度為40℃。兩階段發酵調控保加利亞乳桿菌ATCC 11842 生產GABA，GABA的產量達到5.98g/L，優化后GABA產量比優化前提高了153.39%。
研究表明，兩階段分開控制菌株生長和GABA合成的pH和溫度，能顯著提高 GABA的產量。該方法為用保加利亞乳桿菌ATCC 11842生產富含γ-氨基丁酸的發酵飼料提供了科學依據。
γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，具有降血壓、改善腦機能、增強記憶、抗焦慮等生理功能（Kantachote等，）。GABA作為飼料添加劑，能夠提高動物抗應激能力，改善胴體品質和提高生產性能（汪祥燕等)。潘雪梅等研究發現，GABA可以緩解奶牛夏季的熱應激，提高奶牛免疫能力和機體的抗氧化能力。Park等研究結果表明，GABA作為飼料添加劑能顯著提高蛋雞的生產能力，改善雞蛋品質。常見的生產GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等）。管軍軍等認為，乳酸菌是定植在動物腸道中的益生菌，有利于動物的腸道健康，常被用于制備發酵飼料，有助于動物的健康養殖。徐秀景等研究表明，乳酸菌發酵制備的固態發酵飼料，能夠改善豬肉的品質，提高育肥豬的生長性能。乳酸菌與GABA的聯合生產，能夠顯著改善飼料的營養品質。沈雪嬌等研究發現，產GABA的短乳桿菌P-14發酵飼料應用于育肥豬的飼養，能提高其生產性能，改善豬肉的品質，提高飼料的報酬率。
保加利亞乳桿菌ATCC 11842是一種在食品加工領域重要的益生菌，在乳制品和功能飲料加工過程中已展現出良好的應用前景（毛雪等）。在飼料加工領域，保加利亞乳桿菌ATCC 11842也具有良好的應用前景。本研究通過探索保加利亞乳桿菌ATCC 11842生物合成GABA的規律，為生產富含GABA的發酵飼料提供科學依據。
1.材料與方法
1.1 材料與試劑
GABA標準品、MRS培養基和谷氨酸鈉均購于北京某科技有限公司；
苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸鈉、氫氧化鈉和無水乙醇均購于國藥集團化學試劑有限公司；
保加利亞乳桿菌ATCC 11842保藏于江漢大學湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心食品加工實驗室。
1.2 儀器與設備
V-1600 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；
TG165 型離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；
HH-2 型水浴鍋：國華電器有限公司；
SPX-150B-Z 型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。
1.3 方法
1.3.1 菌體培養與 GABA 生物合成方法
菌體培養方法：保加利亞乳桿菌ATCC 11842活化培養基為MRS固體培養基，培養溫度為30℃；保加利亞乳桿菌ATCC 11842生長培養基為MRS液體培養基，接種量為2%；生長液體培養基置于50mL離心管，裝液量為48mL，調整液體培養基pH，控制培養溫度，厭氧靜置培養，培養36h；每個樣品重復3次。
GABA生物合成方法：在菌體生長液體培養基中添加0.25g谷氨酸鈉底物，調整液體培養基pH，控制培養溫度，生物轉化48h；每個樣品重復3次。
1.3.2 菌體生物量測定方法
定時取0.5mL發酵培養基，6000r/min離心15min，棄上清液，用0.5mL無菌水懸浮菌體，在600nm條件下測定菌體光密度值（吳軍林等）。在600nm波長條件下，繪制菌體生物量與光密度的標準曲線，從而計算出培養基中濕菌體的濃度。
1.3.3 GABA 樣品制備及其檢測方法
GABA樣品制備：取1mL發酵液體培養基于1.5mL離心管，6000r/min離心10min，得到的上清液用于GABA含量的檢測。
檢測方法：取0.3mL上清液于25mL離心管中；依次加入0.2mL的0.2M硼酸鹽緩沖液（pH9.0），1mL的6%苯酚溶液，0.8mL的5%次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻；置于沸水浴中保持10min；然后迅速置于冰浴中保持15min；劇烈振蕩至顯示藍色；最后加入2mL的60%乙醇溶液；在645nm波長條件下檢測光密度值（Zhang等）。
2.結果與分析
乳酸菌生物轉化谷氨酸鈉生物合成GABA分為兩個階段。第一階段為乳酸菌的生長階段，在此階段需要提供乳酸菌良好生長環境，使乳酸菌達到最大的生物量；第二階段是GABA的生物合成階段，在此階段需要控制谷氨酸脫羧酶良好的活性環境，谷氨酸鈉在谷氨酸脫羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等）。Shi等研究表明用短乳桿菌靜息細胞生物轉化谷氨酸生成GABA有兩個關鍵的控制因素，一是pH控制在4.5，二是溫度控制在45℃。Peng等研究結果也表明分步控制溫度和pH條件，用短乳桿菌CGMCC 1306生物轉化谷氨酸能獲得良好的轉化效率。因此，本研究探索分兩階段分別控制菌株的生長和GABA的生物合成，以期提高GABA的產量。
2.1 pH 和溫度對菌株生長的影響
由圖1可知，pH能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時，pH為5、6、7、8、9時的菌體生物量分別為11.60、17.10、15.58、13.93、9.48g/L。pH高于9時，菌株的生長受到顯著抑制。pH為6時菌株的生長最佳。終產物乳酸的積累是抑制乳酸菌生長的重要原因，調節培養基初始pH會影響乳酸菌生長。閆征等研究表明，調節培養基初始pH，乳酸菌在pH6和pH6.5條件下，表現出較好的生長。楊靜等的研究結果也表明，乳酸菌生長的最適pH為5.5~7.0。
由圖2可知，溫度能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時，溫度為25、30、35、40、45℃時的菌體生物量分別為13.60、15.44、16.90、15.62、5.40g/L。溫度高于45℃，菌株生長受到明顯抑制。其中35℃是菌株生長的最佳溫度。王奎明研究結果表明，保加利亞乳桿菌在MRS培養基中和37℃條件下生長良好。培養基組分也會影響保加利亞乳桿菌的最適培養溫度。曾少葵等以牡蠣酶解液為原料，保加利亞乳桿菌的最適生長溫度為40℃。
2.2 pH 和溫度對 GABA 生物合成的影響
pH和溫度會影響酶分子的活性結構以及酶分子與底物的結合（周文斯；陳穩等）。調控反應的溫度和pH對谷氨酸脫羧酶活性有重要影響，進而影響GABA的生物合成（Wu等；時粲等）。
保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS液體培養基中生長36h時，培養基pH降為6.0，當添加0.25g谷氨酸鈉后，培養基pH變為4.5。在此基礎上調整發酵液的pH分別至5、6、7、8、9，溫度為35℃，生物轉化48h后，比較GABA的產量。由圖3可知，pH能顯著影響GABA的產量。在pH為5、6、7、8、9五個不同條件下GABA產量分別為3.25、3.30、3.75、5.0、3.71g/L。其中pH為8時GABA生物合成量最高。隨著菌株的生長，菌株產酸也會使發酵液的pH降低。孟丹等研究表明，乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH為6.5，其發酵液中γ-氨基丁酸的質量濃度為0.22g/L。曾林等從四川泡菜中分離出一株具有產GABA能力的植物乳桿菌BC114，并對其發酵條件進行優化，結果表明，其最佳pH為5.50，GABA產量為3.82g/L。
由圖4可知，溫度能顯著影響GABA的產量。在溫度為25、30、35、40、45℃條件下的GABA產量分別為2.57、2.69、3.33、4.77、3.96g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳溫度。韓昱姝等從泡菜中篩選出一株短乳桿菌LF-fb-017，其GABA產量可達1.68g/L，其最佳生物轉化溫度為37℃。Park等研究結果也表明，乳酸菌來源的谷氨酸脫羧酶最佳活性溫度為41℃。
2.3 優化前后 GABA 產量的比較
參照前期研究方法，保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS培養基中生物轉化谷氨酸鈉合成GABA，在自然pH和恒溫30℃條件下，GABA產量為2.36g/L（Wang等）。用兩階段調控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH6.0，溫度35℃條件下生長36h，再調整發酵液pH至8.0，溫度調整至40℃，生物轉化48h，GABA的產量達到5.98g/L，如圖5。優化后GABA的產量較優化前GABA的產量提高了153.39%。張竺英等（2014）從豆豉中篩選的產γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，該菌株在含1％（W/W）谷氨酸鈉的MRS發酵培養基中，37℃厭氧培養48h后，發酵液中GABA產量達到0.161g/L。史曉萌等從哈薩克族傳統發酵食品中篩選出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA產量達329.81mg/L。吳非等利用紫外線對GABA高產菌株保加利亞乳桿菌L2進行誘變處理，獲得高產GABA突變菌株L2-4，其在含有1%L—谷氨酸改良MRS培養基中的GABA產量達到4.235g/L。因此，保加利亞乳桿菌ATCC 11842 GABA的合成能力顯著高于上述報道的乳酸菌株。
3.結論
本試驗結果表明，對菌株生長和GABA生物合成的pH和溫度進行兩階段分開控制，能顯著提高GABA的產量。菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長36h后，再調整發酵液pH至8.0，溫度40℃，GABA的產量達到5.98g/L。優化后GABA的產量較優化前GABA的產量提高153.39%。
多功能生物發酵活菌肽-產品說明書
打開本產品包裝袋，香氣四溢（養殖場拌料飼喂運用后，整個養殖欄舍中都香氣撲鼻，讓人非常震撼，這種宜人的香醇味是一般產品所無法比擬的），得益于高端的固態發酵技術與大量能量和蛋白飼料的運用，本品1公斤相當于約1.5~2公斤全價飼料能量，有效活菌數高達約200億/克，結合中草藥輔助形成對動物腸道極好的保健效果，健康水平提高大幅度減少用藥成本降低死亡淘汰率。顯著提高飼料消化吸收率，減少排糞量且糞便水份少；生長加速能夠提前出欄；延長產蛋周期且壞蛋比例下降明顯；養殖環境臭味氨氣快速下降，肉蛋奶品質改善明顯。
本產品由多種特異性乳酸菌、產酶芽孢桿菌、布拉氏酵母、產朊假絲酵母、釀酒酵母、雙歧桿菌、丁酸梭菌與部分中草藥發酵而成的高活性發酵飼料產品。
【主要成分】
高濃度復合乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、淀粉酶、復合酶制劑、活性小肽、酸化劑、多維、復合氨基酸等。
【主要載體】
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【規格指標】
粗蛋白≥18%；粗脂肪≥5%；粗灰分≤6%；有效活菌數不同儲存時間在20-200億CUF/g。包裝規格為20公斤/袋。本產品復合飼料衛生標準。
打開多功能生物發酵活菌肽香氣四溢并可以長時間保持，多功能生物發酵活菌肽包裝內物料，顏色會隨著時間長短而有所變化，樣品打開后由于接觸空氣在一周左右可能會霉變，請及時飼喂或者丟棄。產品打開包裝后要及時密封，并請在7-15天內喂完，以免接觸空氣后產生霉變影響質量。
【產品功效】
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2.所選的有益菌的代謝產物可迅速彌補消化道中內源酶的不足，維護腸道微生態平衡，降低腸道負擔，利于營養的吸收，防止畜禽營養性腸道健康問題的發生。
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7.運用本品后輕度霉變飼料可以不再需要添加脫霉劑產品，本品的活性微生物代謝產生霉菌抑制復合物，有效抑制霉菌的生長，降低霉菌毒素的產生，降解部分霉菌毒素，達到解毒效果。較重霉變飼料建議不要使用或者另外添加脫霉劑。
8.改善養殖環境，快速降低養殖環境臭味和氨氣；減少動物糞便排泄量，糞便自然成形并減少糞便含水量，加快動物糞便自然發酵速度。
客戶反饋使用后蛋雞增產明顯
【用法用量】
豬各階段、牛羊、雞鴨鵝家禽與特種養殖上均可使用。混合飼料中飼喂，也可以單獨少量直接補充灑在料槽中飼喂。由于本品1公斤相當于約1.5~2公斤全價飼料能量，在每噸全價飼料中添加本品1包（20公斤）的情況下，可以減少全價飼料40公斤（1包）的使用量。
1.養豬上的運用：日常中每噸飼料使用本品1包（20公斤），初次使用與在周圍疫情嚴重、泌乳期、出欄前1個月可以增加2-4倍的使用量。仔豬、肉豬、母豬各階段都可以使用，用藥和免疫期間不需要停止無副作用。可以與部分全價飼料簡單混合后進入自動供料系統中運用。
2.家禽上的運用：每噸飼料使用本品1包（20公斤），初次使用與在周圍疫情嚴重、蛋禽、出欄前1個月可以增加2-3倍的使用量。
3.牛羊上的運用：每1噸精飼料中使用本品3-5包。
4.特種動物養殖上的運用：每1噸飼料中添加本品2包，出欄前一個月增加一倍的使用量；部分昆蟲養殖上運用本品也有恢復腸道健康和解決一些疑難問題。
5、直接撒喂方法：如果混料不方便等，可以將本產品單獨直接灑到畜禽養殖區投喂，撒喂比例按照1噸飼料運用本品1包的使用量飼養區域，盡量撒散開確保每只畜禽都能夠吃到。由于本產品非常香醇可口，畜禽都會搶吃干凈。每天撒喂1次即可。
6、飲水中運用本產品的方法：規模養殖場自動飲水系統的操作需要將本產品1包放入網紗袋內，浸入到1噸水中來回揉搓3分鐘以上，大部分本產品會融入水中，剩余不溶解的殘渣直接投喂或者拌料。每噸飲水中添加1公斤紅糖并且靜止半小時以上再給動物飲水效果更好；小規模養殖場或者不是自動飲水的養殖場，將本產品1包直接倒入到1噸飲水中后攪動一下給動物飲用即可（加入1公斤紅糖靜止半小時以上效果更好）。本產品益生菌數量多，且中草藥也會大部分會釋放出來，因此飲水也是能夠達到很不錯的效果。
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2020年已全面禁抗，我們之前經常在飼料中添加的抗生素進行促生長行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進動物生長又能夠形成無抗養殖呢？其實中草藥在促進畜禽養殖健康和生長、改善肉蛋奶品質大有可為，特別是將中草藥發酵后效果提升4-28倍等好處，這個實施方案比你想象中效果更好，運用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗證
我們的技術僅需在出欄前半個月左右運用益生菌+酶制劑+中草藥相關的無違禁安全產品，肉質改善非常顯著，且可以批量化生產。
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