多菌混合固態發酵豆粕的工藝研究
豆粕是大豆經提取豆油后得到的副產品，營養成分齊全且均衡。發酵豆粕是通過微生物發酵，去除豆粕中的抗營養因子，提高豆粕的營養性能和使用價值，擴大豆粕的使用范圍。
目前對豆粕固態發酵較多的研究了單菌發酵和兩種細菌混合發酵。吳定等研究了少孢根霉RT-3制備菌絲碎片發酵劑，固態發酵豆粕生產飼料，提高了發酵豆粕蛋白質消化率；劉喚明等研究了由枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發酵生產發酵豆粕的發酵工藝，提高了發酵豆粕的水解度；季偉等利用產Nisin 的乳酸鏈球菌WX506固態發酵豆粕，使發酵粕的生物量達到1.03g/kg ，Nisiin效價達到997 IU/g ；原海兵等采用黑曲霉和米曲霉復合菌株固態發酵法生產豆粕飼料，研究了發酵培養基和發酵條件對固態發酵的影響，得到了最佳工藝條件；王哲奇等采用枯草芽孢桿菌和米曲霉混合固態發酵豆粕，研究發酵產物中多肽的含量；尹慧君等采用不同種微生物，在適宜條件下對豆粕進行固態發酵，有效的消除或降低了豆粕中的抗營養因子。本試驗參照行業標準，選擇可溶性蛋白質和大豆球蛋白為指標，考核豆粕發酵后可利用蛋白質的增加量和抗營養蛋白的減少量。采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌混合固態發酵豆粕，以彌補單菌發酵的不足，更好的提高豆粕的營養和降低生長抑制因子；優化工藝條件，為發酵豆粕的應用提供參考。
1.1 材料 豆粕：益海嘉里公司購得，化學試劑采用國產分析純。 菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌。保存于吉林工商學院食品學院微生物實驗室。菌種含量為1ⅹ 108 CFU/ml ，菌種比例為1：1：1 ，接種量15％ 。 設備：SKD‐2000型凱氏定氮儀，SPH2102C 型立式恒溫培養振蕩器，101-2 型干燥箱，SPX‐150B‐Z 型生化培養箱，YXQ .SG46-280S 型滅菌鍋，BCD‐271 海爾冰箱，SW‐CJ‐２FD 超凈工作臺。 1.2 方法 1.2.1 豆粕發酵工藝 采用張雁平等豆粕發酵工藝方法進行研究。 1.2.2 可溶性蛋白質的測定 按照中華人民共和國國家標準GB/T 19541-2004 獲得上清液，通過茚三酮比色法測定上清液中游離氨基的含量。 1.2.3 大豆球蛋白的測定 采用文獻中的酶聯免疫吸附方法進行測定。 1.2.4 單因素試驗 根據預試驗，在pH7.2環境下，初步確定發酵時間6d 、發酵溫度40℃ 、初始水分40％ 、含糖量２％ 、外源酶（中、酸性蛋白酶）的添加量0.3％ 以及中、酸性蛋白酶的比例３：１ 等6個因素，以可溶性蛋白質和大豆球蛋白為指標，進行單因素試驗。 1.2.5 正交試驗 根據單因素試驗結果，確定對蛋白質含量影響較大的４個因素，進行正交試驗，優化發酵條件。 2.1 單因素試驗結果 2.1.1 發酵時間對蛋白質的影響試驗結果1材料與方法
2結果與分析
由圖１ 可知，隨著發酵時間的延長，可溶性蛋白質的曲線呈現急速上升、較為平緩、再明顯上升的趨勢。１ ～ ３ d上升明顯可能是在多種酶的作用下，大分子蛋白質的降解速度較快，而酶量減少造成了３ ～ ５ d曲線的平緩，５ d 以后，可溶性蛋白質急劇增多，說明在微生物的作用下，大分子蛋白質開始全面降解；大豆球蛋白隨發酵時間的延長總體呈下降趨勢，2 ～ 4 d是大豆球蛋白降解高峰期，4 d 以后，大豆球蛋白含量相對穩定，發酵時間延長，對大豆球蛋白影響不大，說明大豆蛋白已經降解完畢。綜合可溶性蛋白質和大豆球蛋白含量來看，發酵時間5 ～ 7 d 較為理想。
2.1.2 發酵溫度對蛋白質的影響試驗結果
由圖２ 可知，可溶性蛋白質曲線呈現先上升、后下降的趨勢，30 ℃ ～ 55 ℃ 時變化幅度不大，蛋白質含量在110 μmol/g 左右， 40 ℃ 時最高， 為128.3 μmol/g 。大豆球蛋白的曲線是先下降、后上升的趨勢，25 ～ 35℃ 時，下降明顯，45～ 55 ℃ 時，上升明顯，而35 ～ 45 ℃ 時，曲線相對平緩，說明溫度對大豆球蛋白含量的影響較大，綜合來看，35 ～ 45 ℃ 范圍內，兩種蛋白質含量較為理想。
2.1.3 初始水分對蛋白質的影響試驗結果
由圖３ 可知，隨著初始水分的增加，可溶性蛋白質含量呈上升趨勢，水分在30％ ～ 60％ 時，可溶性蛋白質含量增加明顯，之后曲線平緩。說明可溶性蛋白質含量與初始水分具有相關性，而水分達到一定值以后，水分的增加對可溶性蛋白質含量影響不大，因為水分的增加促進水解酶的擴散，造成發酵底物多孔性的降低。大豆球蛋白的含量前期呈驟然下降趨勢，水分達40％ 以后，大豆球蛋白的含量不再變化。綜合兩個因素，初始水分在40％ ～ 60％ 較為理想。
2.1.4 含糖量對蛋白質的影響試驗結果
由圖4 可知，在含糖量0.5％ ～ 2％ 時，可溶性蛋白質含量接近，都比未添加糖時明顯升高，說明糖對可溶性蛋白質含量影響較大，但是糖的含量對可溶性蛋白質影響不明顯。含糖量對大豆球蛋白的影響微乎其微，在糖含量2％ 時，大豆球蛋白含量最低，為15.9 μmol/g 。綜合兩種蛋白質含量看，含糖量2％ 時較為理想。
2.1.5 外源酶的添加量對蛋白質的影響試驗結果
由圖５ 可知，隨著酶添加量的增加，可溶性蛋白質的含量呈上升趨勢，酶添加量在0.15％ ～ 0.3％時，曲線上升明顯，0.3％ ～ 0.6％ 時，上升趨勢稍緩，到0.75％ 時基本變化不大。說明酶的添加量對可溶性蛋白質的影響較大，但是添加量超過0.6％ 以后，對可溶性蛋白質的含量影響不大。大豆球蛋白的含量隨著酶添加量的增加，呈現先下降后上升的趨勢，酶添加量在0.3％ 時，大豆球蛋白含量最低。綜合兩種蛋白質的變化情況，0.3％ ～0.6％ 的酶添加量，較為理想。
2.1.6 中、酸性蛋白酶對蛋白質的影響試驗結果
由圖６ 可知，可溶性蛋白質含量隨著中、酸性蛋白酶比例的增大，曲線呈上升趨勢，開始曲線較為平緩，由2:1到3:1時，曲線上升明顯。大豆球蛋白的含量總體變化不大，基本處于16 μmol/g 附近，說明中、酸性蛋白酶比例的變化對球蛋白的影響不大。綜合兩種蛋白質的含量，中、酸性蛋白酶比例確定為3:1較為理想。
2.2 發酵條件優化結果
根據單因素的實驗結果，確定含糖量為2％ 、中、酸性蛋白酶比例為3:1，選定發酵時間、發酵溫度、初始水分、外源酶添加量4個因素，進行4因素、3水平的正交試驗，因素水平表見表1，正交試驗結果見表2。
由表２ 可知，對可溶性蛋白質含量影響因素順序為：B ＞ A ＞ D ＞ C 。即主要因素是發酵溫度，次主要因素是發酵時間，初始水分與外源酶的添加量為次要因素。最佳組合為A3 B2 C1 D2 。即：發酵時間為7 d 、發酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ 。
對大豆球蛋白含量影響因素順序為：B ＞ A ＞C ＝ D 。即：主要因素為發酵溫度、次主要因素為發酵時間，初始水分與外源酶的添加量為次要因素，且二者數值相同。最佳組合為A3 B2 C3 D2 ，即發酵時間為7d 、發酵溫度40 ℃ ，初始水分為60％ 、外源酶添加量為0.45％ 。
因此，總的影響因素順序為B ＞ A ＞ D ＞ C ；從最佳組合上看，初始水分差別較大，考慮到水分過高，會增加較大的干燥成本，確定初始水分為40％ 。因此總的最佳組合為A3 B2 C1 D2。
2.3 驗證試驗結果
根據正交試驗結果，確定含糖量為２％ 、中、酸性蛋白酶比例為３ ∶ １ 、發酵時間為７ d 、發酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ ，進行驗證實驗，實驗結果為可溶性蛋白的含量為165.8 μmol/g ，大豆球蛋白的含量為11.4 μmol/g ，效果理想。
研究了多菌混合固態發酵的工藝條件，以可溶性蛋白質和大豆球蛋白含量為評價指標，通過單因素試驗，確定了發酵工藝的含糖量為2％ ，中、酸性蛋白酶比例為3：1 。做了發酵時間、發酵溫度、初始水分、外源酶添加量的四因素三水平的正交試驗，得出：發酵溫度為主要因素，發酵時間為次主要因素，初始水分、外源酶添加量為次要因素；最佳組合為A3 B2 C1 D2，即發酵時間為7d 、發酵溫度40 ℃ ，初始水分為40％ 、外源酶添加量為0.45％ 。該條件下發酵豆粕的可溶性蛋白質含量為165.8μmol/g ，大豆球蛋白的含量為11.4μmol/g 。3結論
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