菌酶協同發酵玉米芯制備木聚糖的研究

2021-05-24 15:29:26 點擊：

摘要：為研究固態發酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件，本試驗以木聚糖含量為指標，采用單因素試驗，依次研究單菌發酵、雙菌發酵、菌種比例、單酶發酵、雙酶發酵、雙酶比例、酶的用量對發酵產物中木聚糖含量的影響。

結果表明：發酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1:9,發酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達1.421mg/g，與對照組相比顯著提高了257%。

木聚糖是以β-(1，4)-D-吡喃型木糖構成主鏈，以4-0-甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖(陳國榮等，2009)。木聚糖經酶解可用于制備低聚木糖，機體攝入低聚木糖可顯著促進腸道益生菌的生長。提取木聚糖主要有以下幾種方法:酸水解法(徐曉燕等，2007)、堿液提取法(石波，2001)、蒸汽爆破法（張帆，2013)、蒸煮提取法(趙建等，2004)、預處理-酶水解法(楊瑞金等，2007)等。玉米芯是制備木聚糖的理想原材料之一，據統計，我國每年有2000萬噸以上的玉米芯副產物，可以為木聚糖的制備提供豐富的原料資源(孫軍濤等，2015)。近年來，微生物發酵和酶解技術被應用于制備木聚糖，本試驗以發酵產物中木聚糖含量為評價指標，研究單菌發酵、雙菌發酵、菌種比例、單酶發酵、雙酶發酵、雙酶比例、酶用量對發酵產物中木聚糖含量的影響，為玉米芯的綜合利用及木聚糖的制備提供理論依據。

材料與方法

1 材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌均購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 原料

玉米芯、豆粕、麩皮均購于市場，粉碎過篩。纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶均購買于濟南諾能生物工程有限公司。

1.3 培養基

營養肉湯培養基，MRS肉湯培養基，麥芽汁培養基均購自廣東某生物科技有限公司。固體發酵培養基：80%玉米芯，10%豆粕，10%麩皮。

1.4 儀器

JJ-CJ-1F超凈工作臺、TG16-WS臺式高速離心機、SYQ-DSX-28OB手提式壓力蒸汽滅菌器、CP224C電子天平、GX2智力光照培養箱、Epoch2酶標儀等。

2 方法

2.1 菌種的活化及種子液的制備

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的營養瓊脂平皿中劃線，37℃培養箱培養24h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的營養肉湯培養基中，置于搖床37℃，120r/min培養24h，即為種子液。

植物乳桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的MRS肉湯瓊脂平皿中劃線，36℃培養箱培養24h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的MRS肉湯培養基中，置于搖床36 ℃，120r/min培養24h，即為種子液。

酵母菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的麥芽汁瓊脂平皿中劃線，28℃培養箱培養24 h。待長出菌落后，挑取單個菌落于滅菌的麥芽汁培養基中，置于搖床28℃，120 r/min培養24h，即為種子液。

2.2 試驗設計

本試驗玉米芯固態發酵條件為:發酵溫度36℃，發酵時間72h，裝料量50g，料水比1：1，接種量10%，初始pH為自然pH。以木聚糖含量為指標，采用單因素試驗依次確定出最佳的發酵菌種比例和商品酶種類及用量。

2.3 木聚糖提取液的制備

固態發酵后，將發酵產物與無菌蒸餾水以1：10的比例裝人三角瓶中，置于37 ℃的恒溫水浴搖床以135r/min振蕩1h，然后5000r/min，4℃離心10min，提取上清液待測。

2.4 檢測指標

還原糖測定方法:3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)。

式中:m為還原糖的質量;M為待測產物的質量(丁勝華等，2010)。

3 數據分析

所有試驗均重復三次，試驗結果運用SASS 9.2軟件，采用單因子方差分析(ANO-VA)并用Duncan’s方法對各組間平均數進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，用Excel 2016對數據進行整理并繪圖。

結果與分析

1 單菌發酵玉米芯對發酵產物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌分別發酵玉米芯，發酵產物中的木聚糖含量見圖1，對照組為不加菌發酵。

由圖1可知，四株菌都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌發酵玉米芯的產物中木聚糖含量最高，為0.764mg/g，與對照組相比提高了282%(P<0.05)，故確定單菌最佳發酵菌種為枯草芽孢桿菌。

2 雙菌發酵玉米芯對發酵產物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌分別與地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌組合發酵玉米芯，發酵產物中的木聚糖含量見圖2，對照組為不加菌發酵。

由圖2可知，三種菌種組合都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌和酵母菌組合發酵玉米芯的產物中木聚糖含量最高，為0.991mg/g，與對照組相比提高了395%(P<0.05)，故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的組合為發酵玉米芯的最佳菌種組合。

3 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對玉米芯發酵產物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例發酵玉米芯，發酵產物中木聚糖含量見圖3，對照組為不加菌發酵。

由圖3可知，枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中當枯草芽孢桿菌與酵母菌的比例為1：9時，發酵產物中木聚糖含量最高，為1.108mg/g，與對照組相比提高了454%(P<0.05)，故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例為1：9。

4 單酶發酵玉米芯對發酵產物中木聚糖含量的影響

發酵玉米芯時，分別添加纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶，發酵產物中的木聚糖含量見圖4,對照組為不加酶發酵。

由圖4可知，發酵時添加這四種酶都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中添加纖維素酶的發酵產物中木聚糖含量最高，為1.319mg/g，與對照組相比提高了 231%(P<0.05)，故確定最佳發酵單酶為纖維素酶。

5 雙酶發酵玉米芯對發酵產物中木聚糖含量的影響

纖維素酶分別與木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合發酵玉米芯，發酵產物中的木聚糖含量見圖5,對照組為不加酶發酵。

6 纖維素酶與木聚糖酶的比例對玉米芯發酵產物中木聚糖含量的影響

纖維素酶與木聚糖酶以不同比例發酵玉米芯，發酵產物中木聚糖含量見圖6，對照組為不加酶發酵。

由圖6可知，纖維素酶與木聚糖酶以任何比例都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中當纖維素酶與木聚糖酶的比例為1：0時，發酵產物中木聚糖含量最高，為1.498mg/g，與對照組相比提高了276%(P<0.05)，故確定纖維素酶與木聚糖酶的比例為1：0,即纖維素酶為最佳發酵添加酶。

7 纖維素酶的添加量對玉米芯發酵產物中木聚糖含量的影響

纖維素酶以不同添加量發酵玉米芯，發酵產物中的木聚糖含量見圖7,對照組為不加酶發酵。

由圖7可知，纖維素酶以任何添加量都可以增加發酵產物中木聚糖的含量，其中當纖維素酶添加量為1000U和4000U時，發酵產物中木聚糖含量最高，分別為1.421、1.446mg/g，與對照組相比分別提高了257%、263%，但差異不顯著(P>0.05)，考慮到成本，故選擇纖維素酶最適添加量為1000U/g飼料。

討論

玉米芯是木聚糖含量最高的農副產品，含量為35%〜40%，是制備木聚糖的最佳原料。李里特(2004)、楊瑞金(2000)、邵佩蘭等(2000)利用不同的提取方法證明，從玉米芯中提取木聚糖是可行的，而且提取率較高，羅曉風(2005)等用堿法提取木聚糖的得率為22.7%。本試驗結果表明，在枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1：9,發酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料的條件下，木聚糖含量可達1.421mgg，與對照組相比顯著提高了257%。

玉米芯中主要的多糖為纖維素、半纖維素和木質素，半纖維素主要是由木聚糖組成，因此半纖維素含量的高低直接決定著木聚糖的得率。由于纖維素與半纖維素、木質素等以多種物理或化學作用結合，形成致密的木質纖維結構，單純使用酶降解玉米芯會導致酶解效率不高，生產成本增大(何亮亮，2012)。因此，要保證在實際生產中纖維素酶有較高的酶解效率，必須消除木質纖維在結構上的酶解障礙，因而在對木質纖維進行酶解之前，采用適當的方法進行預處理是必要的。常用方法之一是利用細菌、真菌等微生物的降解作用達到去除木質素，使纖維組織松散的目的。Zhang等(2007)用白腐菌處理的竹子降解后的還原糖得率是未處理樣品的2.34倍，顯示出較好的處理效果。枯草芽孢桿菌與酵母菌是微生物發酵技術常用的發酵菌種，都具有產纖維素酶的能力（甄玉國，2005;Antonio等，2004)，本試驗通過使用枯草芽孢桿菌、酵母菌與纖維素酶協同發酵玉米芯，可以降解玉米芯中部分半纖維素使其表面出現空隙，增加酶和纖維素的可接觸面積，從而提高酶解率及木聚糖產量(鄭志，2012)。本試驗可為菌酶協同制備木聚糖的研究提供一些理論依據。

結論

在本試驗條件下，發酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1：9,發酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達1.421mg/g，與對照組相比顯著提高了257%。

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