利用廢紙資源發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究及應用

2021-06-07 15:35:39 點擊：

纖維素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶。作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物。微生物纖維素酶在轉(zhuǎn)化不溶性纖維素成葡萄糖以及在果蔬汁中破壞細胞壁從而提高果汁得率等方面具有非常重要的意義。

纖維素酶是繼淀粉酶和蛋白酶之后的全球第三大工業(yè)用酶制劑，被廣泛地應用于生物能源、食品、造紙、紡織洗滌、醫(yī)藥、動物飼料以及農(nóng)業(yè)廢棄物處理等領域。但是昂貴的發(fā)酵生產(chǎn)成本是目前制約纖維素酶行業(yè)快速發(fā)展的主要瓶頸。而廢紙作為可回收利用的廢棄物資源之一，由于其纖維素含量高、價格低廉、來源廣泛、易獲取及產(chǎn)生量大等特點具有良好的開發(fā)應用潛力。因此，利用廢紙資源進行纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以有效降低纖維素酶發(fā)酵成本，而且還能實現(xiàn)廢紙資源的高值化利用。

近日，中國科學院近代物理研究所生物物理室研究人員在利用廢紙發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究方面取得進展。相關(guān)成果發(fā)表在環(huán)境科學領域期刊Journal of Cleaner Production上。

研究人員利用重離子束誘變選育的長枝木霉突變菌株LC-M4進行廢紙?zhí)荚窗l(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用的辦公廢紙、餐巾廢紙、雜志紙和硬紙板紙四種類型的廢紙中，硬紙板紙發(fā)酵的濾紙酶活（FPA）、內(nèi)切葡聚糖酶活（CMC）、β-葡萄糖苷酶活（BGL）和木聚糖酶活（Xyl）分別達到了2.97 IU/mL、4.8 IU/mL、0.51 IU/mL和382.59 IU/mL，表明LC-M4菌株可有效利用硬紙板紙為碳源產(chǎn)酶。通過廢紙結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)：不同廢紙中纖維素為主要成分，造紙過程中添加的碳酸鈣等填料可以為菌株生長和產(chǎn)物合成提供營養(yǎng)元素，對發(fā)酵過程有促進作用。為進一步提高廢紙?zhí)荚窗l(fā)酵酶活，選用硬紙板紙和麩皮混合碳源發(fā)酵，BGL最高達到0.80 IU/mL，比硬紙板紙單一碳源酶活提高了56.86%；外切葡聚糖酶活（pNPC）、FPA和Xyl也有了一定的提高，其中Xyl達到399.74 IU/mL，較微晶纖維素碳源發(fā)酵酶活（343.09 IU/mL）提高了16.51%。表明廢紙和麩皮作為產(chǎn)酶發(fā)酵碳源具有很高的應用價值和市場開發(fā)潛力。

菌種選育

菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎性工作，國內(nèi)外許多專家進行了大量研究，為了生產(chǎn)高質(zhì)量的纖維素酶產(chǎn)品，王家林等（1996）在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗的基礎上，先后引進了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學的誘變方法，獲得了高產(chǎn)菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g, C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達到國際先進水平。此菌種在工廠化生產(chǎn)中性能穩(wěn)定。張苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，經(jīng)過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線（15W、30cm、2min）復合誘變后，得到了產(chǎn)酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達到2975，濾紙?zhí)敲富钚詾?31，比出發(fā)菌W-925分別提高了100%和81%。化工部飼料添加劑技術(shù)服務中心王成書等（1997）采用該中心的里氏木霉A3先進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，30℃培養(yǎng)5-8天，15℃放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到了產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。

纖維素酶菌種易退化，退化后其產(chǎn)酶力明顯降低，其原因可能有三個方面：

①經(jīng)誘變篩選的菌種發(fā)生回復突變。

②自然負突變。

③菌種長時間低溫斜面保藏，會在分生孢子上長出次生菌絲，而次生菌絲所形成的分生孢子生命力弱，這可能是菌種退化的主要原因。為了避免纖維素酶菌種退化，張苓花等（1998）報道，采用砂土管保藏菌種。即將過篩洗凈的砂子與土以3：2比例混合分裝在試管內(nèi)，用1kg/cm2壓力滅菌30分鐘共三次，將欲保存的斜面菌種制備成1000ml孢子懸浮液，每個砂土管注入0.5ml，搖勻，放入盛有無水CaCl2真空干燥器內(nèi)保存。經(jīng)測定，在所測的121天內(nèi)，酶的活性基本不變；酶活性下降50%的時間，由常規(guī)方法的60天延長至160天，明顯地減緩了菌種退化速度。

發(fā)酵工藝

纖維素酶的生產(chǎn)工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其工藝如下：

影響產(chǎn)酶量和活力的因素

影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。張中良等（1997）采用均勻設計Cl12(1210)，以綠色木霉（T.ViriclePers.expr）為菌種，研究了影響產(chǎn)纖維素酶的五大因素對產(chǎn)酶量和活力的作用，認為基質(zhì)粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃條件下培養(yǎng)45h可獲得最大產(chǎn)酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成華等（1997）也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明該菌種以7：3的秸稈粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基，28-32℃為適宜培養(yǎng)溫度，30℃為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達發(fā)酵高峰。張苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925為出發(fā)菌，經(jīng)誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，以1：2的麥麩和稻草粉為培養(yǎng)基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始pH4-5，溫度在28-35℃，發(fā)酵時間72h為最佳發(fā)酵條件。

污染菌的控制

飼用纖維素酶普遍存在一種俗稱的“白毛菌”污染。污染后輕者酶活性下降，重者發(fā)酵失敗。為此，研究控制發(fā)酵污染意義很大。張苓花等（1998）研究“白毛菌”的菌落特征、來源、生長和生理特征及控制方法，找到了一種與康氏木霉Wu-932呈共生關(guān)系，而與“白毛菌”呈競爭性抑制關(guān)系的熱帶假絲酵母菌J-931。利用此菌進行混合發(fā)酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。

農(nóng)業(yè)應用

纖維素酶在畜禽生產(chǎn)中的應用：

常見的畜禽飼料如谷物、豆類、麥類及加工副產(chǎn)品等都含有大量的纖維素。除了反芻動物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它動物如豬、雞等單胃動物則不能利用纖維素。

以下是纖維素酶在牛、雞、豬日糧中的應用：

牛日糧

焦平林等（1996）用閹牛試驗，在日糧中按每頭每日添加纖維素酶40g，飼喂60天，結(jié)果表明加酶組日增重892.78g，對照組日增重746.8g，差異極顯著（P<0.01）。焦平林又用30頭荷斯坦奶牛進行試驗，試驗組按每頭每日添加50g纖維素酶，結(jié)果表明，試驗組15頭奶牛在68天總產(chǎn)奶量為2916kg,而對照組15頭奶牛在68天的總產(chǎn)奶量為2689kg，差異顯著（P<0.05）。付連勝等（1998）報道，在瘤胃功能正常狀態(tài)下，成年奶牛及育成牛飼喂纖維素酶5天后，其糞便干物質(zhì)和飼喂前相比，減少30%，一周后，封閉式牛舍氨含量下降70%左右，粗飼料采食量提高8-10%，尿中尿素下降58.9%，懷孕奶牛在產(chǎn)前30天始飼喂纖維素酶，分娩后，不產(chǎn)生生理性消化不良癥狀，胎兒體重可增加1.5-3kg，并無畸形和弱胎。產(chǎn)牛體質(zhì)恢復快，產(chǎn)奶高峰維持時間長（一直至第四個泌乳月）。趙長友等（1998）綜述了纖維素酶在草食動物日糧中的應用，均取得了顯著效果。

雞日糧

肉雞日糧一般以高魚粉、高玉米、高豆粕為主。為減少這些常規(guī)原料的使用量，廣泛采用廉價的飼料原料，秦江帆等（1996）在肉雞日糧中提高富含纖維的麥麩比例，添加0、0.05%、0.1%纖維素酶制劑進行試驗，結(jié)果表明，添加0.1%纖維素酶組比對照組在1-2、3-6、7-8周三個生長階段日增重分別提高4.31%、4.54%、4.13%，耗料比分別下降1.56%、4.50%、4.3%。徐奇友（1998）在蛋雞日糧中添加0.1%、0.15%、0.5%纖維素酶，結(jié)果表明，在1-10月的產(chǎn)蛋期間，產(chǎn)蛋率分別提高0.53%、1.25%、2.88%，酶水平0.15%和0.5%組的破蛋率降低34.49%、16.19%，蛋殼強度分別提高14.71%和8.41%。

豬日糧

據(jù)尹清強等（1992）報道，在基礎日糧中添加0.6%和1.2%纖維素復合酶，結(jié)果生長育肥豬增重比對照組分別提高16.84%和21.86%。Wank等（1993）報道，添加纖維素酶，使中性洗滌纖維消化率由30.3%提高到34.1%，酸性洗滌纖維消化率從68.8%提高到73.9%，能量消化率由69.3%提高到71.8%。

纖維素酶產(chǎn)業(yè)開發(fā)展望

我國是一個飼料資源十分緊張的國家，土地少、人口多，人畜爭糧的矛盾十分突出。要保持我國飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，必須解決好飼料問題，否則將嚴重制約其發(fā)展。纖維素是自然界中十分豐富的資源，是800-1200個葡萄糖分子聚合而成。因此，可通過微生物發(fā)酵充分利用農(nóng)副產(chǎn)品下腳料、秸稈、糠生產(chǎn)纖維素酶添加劑，用于提高畜禽生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，改善飼料的營養(yǎng)價值，降低飼料成本和提高經(jīng)濟效益，具有廣闊的開發(fā)前景，今后應進一步加強纖維素酶研究和開發(fā)工作。主要有如下幾方面：

進一步加強纖維素酶的作用機制研究

纖維素酶應用于飼料，作用于動物消化道，其機制尚未清楚。從理論上決定其添加量還很困難，受影響因素很多，往往效果不夠理想。對于單用多種原料的纖維素酶最佳添加量也研究不多，這將嚴重制約纖維素酶的推廣應用。

酶的產(chǎn)量和活性都不高，成本偏高

今后應加強菌種選育和發(fā)酵工藝等基礎研究工作，以提高其產(chǎn)量和活性，特別是要注意利用DNA基因重組技術(shù)的應用，來選育出活性高、產(chǎn)酶量大的菌種。

加強纖維素酶檢測方法研究

雖然纖維素酶的檢測方法很多，但真正能適合飼料的檢測方法還沒有，這給實際應用工作帶來困難，如無法比較不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量，確定纖維素酶添加量也很困難，應組織有關(guān)力量，制訂出統(tǒng)一的檢測方法標準，供生產(chǎn)中應用。

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